Southern-Analyse der T-DNA-Insertion in der Mutante sng1-4

In einem zweiten Ansatz zur Isolation von genomischer DNA aus dem SNG1-Gen wurde die Methode der inversen PCR angewendet (Ochmann et al. 1990; Gasch et al. 1992; Lindsay und Topping 1996; Topping und Lindsay 1997). Um solche Fragmente zu finden, die dafür geeig-net waren, d.h. von einer der T-DNA-Seiten stammten und flankierende genomische DNA enthielten, war eine Southern-Analyse der T-DNA-Insertion in der Mutante sng1-4 von Ara-bidopsis erforderlich. Genomische DNA der Mutante wurde dazu für jede Seite mit einer Reihe von Restriktionsenzymen (s. Abb. 5 u. 6) verdaut und auf eine Membran übertragen. Die Auswahl der Enzyme erfolgte unter Beachtung eine Reihe von Kriterien. Es musste für das je-weilige Enzym in zumindest einer der T-DNA-Seiten eine Schnittstelle vorhanden sein. Um eine möglichst geringe Anzahl von Fragmenten aus der T-DNA freizusetzen, die mit den Son-den reagieren konnten, waren singuläre Schnittstellen am besten geeignet. Eine Schnittstelle sollte weiterhin einen Abstand von mehr als ca. 0,5 kb zum jeweiligen Seitenende haben, ande-rerseits aber auch nicht mehr als ca. 3 kb Distanz dazu besitzen. Ansonsten würde entweder der Bereich für die Auswahl der Primer zu klein sein oder eventuell insgesamt ein zu großes Fragment entstehen (s.u.). Das linke Seitenende wird zudem häufig nicht vollständig in das Ge-nom integriert, so dass darin gelegene Schnittstellen in der T-DNA eventuell nicht vorhanden sind. Informationen zur Sequenz der T-DNA, die der Auswahl von Enzymen zugrunde lag, Abb. 4. Karte der T-DNA des Ti-Plasmids pGV3850:pAK1003. − A Gesamte T-DNA, LS: linke Seite, RS: rechte Seite, pLe: Plasmid im Rescue von LS mit Sa, pRe: Plasmid im Rescue von LR mit E, pRi:

sog. internes Plasmid im Rescue von RS, pBR322: ungefähr zwischen E und Sa; X: flankierende geno-mische DNA; B Abschnitt von LS, P4 und P5: Primer für inverse PCR; C Abschnitt von RS; Schnitt-stellen der Restriktionsenzyme, E: EcoRI, Sa: SalI, H: HindIII, S: SacII, Hc: HincII, Br: BsrBI, Bc:

BclI und N: NruI, alle in der T-DNA vorhandenen für E und Sa, ausgewählte Stellen für die anderen.

B

P5 P4

Br Bc

E N

Bc

100 bp X

C

Bc Hc

H S X

1 kb 1 kb pRi

E

E E H

RS

Sa Sa Sa

pLe

S T-DNA

N LS

pRe

A

X ^{pBR322 pBR322} X

sind z.B. in Feldmann (1992) zu finden. Es wurden darüber hinaus solche Enzyme bevorzugt eingesetzt, für die in der genomischen DNA von Arabidopsis viele Schnittstellen vorhanden sind und die keine glatten, sondern überhängende Enden erzeugen. Diese können in einer inversen PCR effizienter ligiert werden.

Für jede Seite der T-DNA wurde ein Southern Blot mit den ausgewählten Enzymen angefertigt (s. Abb. 5 u. 6). Darüber hinaus wurden Verdaus mit den Enzymen EcoRI und SalI mitgeführt, die für das Plasmid-Rescue verwendet wurden (s. Abschn. 4.2.1). Um eine große Auflösung zu erzielen, wurde zur Auftrennung der Fragmente genomischer DNA eine Kammer mit großer Laufstrecke (14 cm) verwendet. Zur Analyse der T-DNA-Insertion wurden die Blots nacheinander mit verschiedenen Fragmenten der T-DNA als Sonden hybridisiert. Es wurden dabei die gleichen Fragmente der gesamten T-DNA-Seiten verwendet wie für das Plas-mid-Rescue (s. Abschn. 4.2.1), weiterhin das sog. interne Plasmid pRi (Behringer und Medford 1992), das den Abschnitt der T-DNA repräsentiert, der nicht zu diesen Seiten gehört (s. Abb.

4). Dieses Plasmid wurde für eine effektive radioaktive Markierung zusätzlich durch Verdau mit dem Enzym EcoRI linearisiert. Außerdem wurden Sonden eingesetzt, die nach Möglichkeit nur mit den Fragmenten reagieren sollten, die von den Seiten der T-DNA stammten und flan-kierende genomische DNA enthielten, nicht aber mit Fragmenten aus der T-DNA. Bei diesen Sonden handelte es sich um die äußersten Abschnitte der T-DNA-Seiten. Ein 0,6 kb-Fragment der rechten Seite wurde aus dem Plasmid pCC1 durch Verdau mit den Enzymen HincII und BclI freigesetzt, ein 0,6 kb-Fragment der linken Seite aus dem Plasmid pCS610 durch Verdau mit den Enzymen BsrBI und EcoRI (s. Abb. 4). Für den Verdau mit dem Enzym BclI, das hinsichtlich einer dam-Methylierung in E. coli empfindlich ist, wurde das Plasmid pCC1 durch Elektroporation in den E. coli-Stamm DM1 transformiert. Die genannten Sondenfragmente wurden nach Verdau und Elektrophorese aus dem Agarosegel extrahiert, radioaktiv markiert und mit den Blots hybridisiert.

Für beide Seiten der T-DNA wurde ein Spektrum von Fragmenten unterschiedlicher Größe und Signalstärke erhalten. Als Beispiele seien die Southern Blots für die linke und rechte Seite der T-DNA gezeigt (s. Abb. 5 und 6), die mit den Fragmenten der ganzen T-DNA-Seiten ana-lysiert wurden. Im Verdau mit dem Enzym SalI wurde dabei auf der linken Seite (s. Abb. 5, Verdau Nr. 1) ein Fragment mit einer Größe von 25 kb identifiziert, auf der rechten Seite mit dem Enzym EcoRI zwei Fragmente mit Größen von 11 kb und 25 kb (s. Abb. 6, Verdau Nr.

1). Dabei handelte es sich um die durch das Plasmid-Rescue zu isolierenden Fragmente der vorliegenden T-DNA-Insertion (s. Abschn. 4.2.1). In den einzelnen Verdaus wurden danach geeignete Fragmente für die inverse PCR ausgesucht, wobei erneut verschiedene Kriterien beachtet wurden. Das gewählte Fragment durfte nicht mit den Sonden von der anderen Seite reagieren. Ein solches Verhalten wurde als Hinweis darauf gewertet, dass das Fragment aus einem Bereich stammte, in dem zwei T-DNAs sehr dicht beieinander liegen. Ein derartiges Fragment enthielt wahrscheinlich wenig oder keine flankierende genomische DNA. Aus diesem Grund durfte das Fragment auch nicht mit dem internen Plasmid hybridisieren. Diese Reaktion

hätte hingewiesen auf Prozesse wie eine Rekombination oder die unvollständige Insertion von T-DNAs, die zu veränderten und nicht vorhersehbaren T-DNA-Strukturen führen (s. Abschn.

5.1). Das gesamte Fragment sollte eine Größe von ca. 10 kb, der zu amplifizierende Abschnitt genomischer DNA eine solche von ca. 3 kb nicht überschreiten. Dadurch würde vermutlich die Effizienz der Zirkularisierung des Fragments oder diejenige der Amplifikation des genomischen Teils mittels inverser PCR erheblich reduziert. Um eine geeignete Sonde für das SNG1-Gen zu erhalten, sollte der zu amplifizierende Abschnitt dagegen eine Größe von mindestens ca. 0,5 kb aufweisen. Es wurden weiterhin Fragmente nicht berücksichtigt, die in ihrer Größe den Teilen der T-DNA entsprachen, die durch den jeweiligen Verdau hätten freigesetzt werden müssen.

Dazu gehörten auch solche Fragmente, die entstehen würden, wenn die Insertion aus mehreren T-DNAs in konkatemerer Anordung bestand (s. Abschn. 5.1). Dabei wurde die Aneinander-lagerung von gleichen und verschiedenen Seiten der T-DNAs berücksichtigt. Die Größen der Fragmente und Abschnitte wurden anhand der bekannten Sequenz des T-DNA-Vektors (s.o.) abgeschätzt.

Bei der Interpretation der Blots musste aber berücksichtigt werden, dass ein Abschnitt von 1,5 kb aus der linken Seite der T-DNA nicht sequenziert worden war. Darin befanden sich eventuell weitere Schnittstellen der eingesetzten Enzyme, so dass in den Verdaus noch andere Fragmente als erwartet auftreten konnten. Soweit die Southern-Analyse einen Einblick in die Abb. 5. Southern Blot von der Arabidopsis-Mutante sng1-4 hybridisiert mit dem Fragment der linken Seite der T-DNA. − Restriktionsenzyme, 1: SalI, 2: HindIII, 3: ClaI, 4: BclI, 5: ScaI, 6: HincII, 7:

EcoRV, 8: DraI, 9: PstI und 10: NsiI; Pfeil: 0,8 kb-Fragment für die inverse PCR (s. Abschn. 4.2.3).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

23 kb 10 kb 3 kb 2 kb

1 kb

0,5 kb 5 kb

Struktur der T-DNA-Insertion gewähren konnte, sollten bevorzugt Fragmente von der Seite für die inverse PCR ausgewählt werden, deren Analyse sich insgesamt als schlüssiger und einfacher erwies. Bei der Interpretation der Blots musste zudem in Rechnung gestellt werden, dass ein Signal mehr als ein Fragment repräsentieren konnte und dass kleinere Fragmente unter Umständen kein erkennbares Signal ergeben würden. In dem vorliegenden Fall erwies sich die linke Seite der T-DNA-Insertion als weniger komplex, so dass auf dieser Seite für die inverse PCR Fragmente in den Verdaus der Restriktionsenzyme DraI, ScaI, PstI und BclI aus-gewählt wurden, welche die genannten Kriterien weitgehend erfüllten. Es handelte sich dabei um die Fragmente mit einer Größe von 1,6 kb (DraI), 1,8 kb und 4,8 kb (ScaI), 4,8 kb (PstI) und 0,85 kb (BclI) (s. Abb. 5).