SNP-Detektion

Pyrene sind dafür bekannt, dass sie Excimere ausbilden. Dies wurde bereits zur Detektion von Basenfehlpaarungen in DNA Duplexen^[233], Molecular Beacons^[234] und ähnlichen DNA-Konstrukten^[235] ausgenutzt. In unserer Gruppe gelang es, mit Perylenbisimiden Basenfehlpaarungen in Duplexen nachzuweisen.^[119] Dabei wurden zwei Perylenbisimide in einen Einzelstrang im Abstand eines Adenins eingebaut. Im Duplex kam es bei korrekter Adenin-Thymin-Paarung zu einer Separation der Chromophore, wodurch die optischen Eigenschaften des monomeren Perylenbisimids beobachtbar wurden.

N

Abbildung 5-1: Perylenbismimid (links), Pyren-modifizierte DNA Sonde zur Detektion von Basenfehlpaarungen (rechts).

Wenn es mit dem Adenin zwischen den beiden Chromophoren durch einen entsprechenden Gegenstrang zu einer Basenfehlpaarung kam, wurde dies durch excitonische Absorption und excimere Fluoreszenz angezeigt. Entsprechend dieser Experimente sollte Thiazol Orange als potentiell wechselwirkendes Chromophorenpaar in einen entsprechenden Einzelstrang eingebaut werden, um Basenfehlpaarungen durch Dimerbildung und den bereits beschriebenen optischen Eigenschaften anzuzeigen. Folgende DNA-Sequenzen wurden synthetisiert:

SNP-Detektion DNA34: 5’-TG-CAT-GCA-TOATO-ACT-GAC-3’

DNA35: 3’-AC-GTA-CGT---CAC---TGA-CTG-5’

DNA36: 3’-AC-GTA-CGT---CTC---TGA-CTG-5’

DNA37: 3’-AC-GTA-CGT---CGC---TGA-CTG-5’

DNA38: 3’-AC-GTA-CGT---CCC---TGA-CTG-5’

DNA39: 3’-AC-GTA-CGT---C—C---TGA-CTG-5’

DNA34 bildet mit DNA35 als Gegenstrang den richtig gepaarten Duplex; mit DNA36 bis DNA38 hingegen kommt es zu Basenfehlpaarungen des zentralen Adenins.

DNA39 stellt keine Gegenbase zum Adenin zur Verfügung, dadurch sollte es aus dem DNA Duplex herausgedrängt und beide Thiazol-Orange-Chromophoren zur Wechselwirkung miteinander gezwungen werden.

Im Absorptionsspektrum (Abbildung 5-2) ist ein deutlicher Unterschied zwischen den Einzel- und Doppelsträngen zu sehen.

400 450 500 550 600

0.0

Abbildung 5-2: Absorptionsspektren von DNA34 und den Duplexen DNA34-35 bis DNA34-39. 2.5 µM DNA, 10 mM NaP_i, pH 7, 250 mM NaCl, 20 °C.

Der Einzelstrang DNA34 weist excitonische Wechselwirkungen auf, mit einem Maximum bei 482 nm. Dies liegt daran, dass sich der Einzelstrang willkürlich faltet und sich in diesem DNA-Knäuel beide Thiazol-Orange-Chromophore räumlich nahe kommen können. Dadurch wechselwirken beide Farbstoffe miteinander, was an excitonischen Absorptionsbanden zu beobachten ist. Diese Absorptionsbande ist

18 und DNA19-20 (vergleiche Kapitel 4.3) zu beobachten war. Alle Duplexe DNA34-35 bis DNA34-39 zeigen Monomerabsorptionen mit einem Maximum bei 510 nm und einer Schulter bei 490 nm. Selbst Duplex DNA34-39, der das Adenin aus dem Duplex drängen und so optimale Wechselwirkungen zwischen beiden Chromophoren ermöglichen sollte, weist nur optische Eigenschaften auf, die denen des monomeren Thiazol Oranges entsprechen.

Auch im Fluoreszenzspektrum (Abbildung 5-3) sind hauptsächlich Banden zu sehen, die monomerem Thiazol Orange in DNA gleichen.

500 550 600 650 700

0.0

Abbildung 5-3: Emissionsspektren von DNA34 und den Duplexen DNA34-35 bis DNA34-39. 2.5 µM DNA, 10 mM NaP_i, pH 7, 250 mM NaCl, λ_exc = 490 nm, 20 °C. Foto von links nach rechts: DNA34, DNA34-35, DNA34-36, DNA34-37, DNA34-38, DNA34-39. 2.5 µM DNA, 10 mM NaPi, pH 7, 250 mM NaCl, 20 °C, angeregt mit einer herkömmlichen UV-Lampe.

Alle Fluoreszenzen unterscheiden sich lediglich in ihrer Intensität. Die intensivsten Emissionen sind bei Duplex DNA34-37 zu beobachten, dieser Duplex weist ein Guanin gegenüber Adenin auf. Die RFI-Werte (Tabelle 5-1) liegen im Bereich 1.28 bis 1.63 und damit weder nahe am RFI-Wert der monomeren Fluoreszenz (2.54) noch an dem RFI-Wert der dimeren Emission (<1.0).

SNP-Detektion

Tabelle 5-1: Charakteristische Daten der Duplexe DNA34-35 bis DNA34-38. 2.5 µM DNA, 10 mM NaPi, pH 7, 250 mM NaCl, λ_exc = 490 nm, 20 °C.

DNA FI_max/nm R_FI (FI_533nm/FI_585nm)

DNA34-35 541 1.40

DNA34-36 535 1.63

DNA34-37 538 1.57

DNA34-38 542 1.33

DNA34-39 543 1.28

Werden diese DNA-Lösungen mit einer UV-Lampe angeregt (Abbildung 5-3, Foto), wird sichtbar, dass hauptsächlich grüne Emissionen vorliegen. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich das Dimer aus beiden Thiazol-Orange-Chromophoren innerhalb dieser DNA-Sequenz nur zu einem geringen Anteil ausbildet. Selbst dann nicht, wenn man sie mit Gegenstrang DNA39 in räumliche Nähe zueinander zwingen möchte.

Dies könnte daran liegen, dass das zentrale Adenin bereits als Spacer zu viel Raum einnimmt und schon von vornherein Wechselwirkungen beider Chromophore unterbindet.

Bei DNA21-18 und DNA22-20 konnte durch die antiparallele Anordnung beider Chromophore eine Emissionsverschiebung erreicht werden, wenngleich diese eine starke Löschung erfahren hat. Um eine mögliche Dimerausbildung bei antiparalleler Anordnung beider Chromophore zu überprüfen, wurden folgende DNA-Sequenz synthetisiert:

DNA40: 5’-TG-CAT-GCA-TOATO’-ACT-GAC-3’

DNA39: 3’ AC-GTA-CGT--C----C---TGA-CTG 5’

Dabei wurde TO’ über den Chinolin-Stickstoff in den Einzelstrang DNA40 eingebaut. Als Gegenstrang dient DNA39, der durch das Fehlen einer Gegenbase zu Adenin beide Chromophore in möglichst enge Nähe zueinander zwingt.

Im Absorptionsspektrum (Abbildung 5-5, links) sind nahezu keine Unterschiede zwischen Einzel- und

Doppelstrang zu erkennen, nur minimale Abweichungen in der Intensität. Allerdings zeigt die stark ausgeprägte Schulter bei 490 nm die excitonischen Wechselwirkungen der Chromophore an.

400 450 500 550

0.00

500 550 600 650 700 750 0

Absorption [OD] Fluoreszenzintensität I [c.p.s.]

Wellenlänge [nm] Wellenlänge [nm]

Abbildung 5-5: Absorptions- (links) und Emissionsspektren (rechts) von DNA40 und DNA40-39.

2.5 µM DNA, 10 mM NaPi, pH 7, 250 mM NaCl, λ_exc = 490 nm, 20 °C. Foto DNA40 (links) und DNA40-39 (rechts), 2.5 µM DNA, 10 mM NaPi, pH 7, 250 mM NaCl, 20 °C, angeregt mit einer herkömmlichen UV-Lampe.

Das Emissionsspektrum (Abbildung 5-5, rechts) zeigt ein Maximum bei 530 nm mit einer Schulter bei 570 nm, dies ist die charakteristischen Fluoreszenz des Thiazol-Orange-Monomers. Das Dimer bildet sich also auch nicht bei antiparalleler

N S

Abbildung 5-4: unterschiedliche Anknüpfung des Thiazol-Orange-Chromophors an DNA.

Molecular Beacon Die mit einer UV-Lampe angeregten DNA-Lösungen zeigen eine grüne Emissionsfarbe (Abbildung 5-5, Foto). Auch die RFI-Werte zeigen Werte in einem Bereich, die der monomeren Fluoreszenz zuzuordnen ist. (Tabelle 5-2). Leider eignet sich das Thiazol-Orange-Dimer nicht zur Detektion von Basenfehlpaarungen, wie es mit den Perylenbisimid-Excimeren möglich war.

Tabelle 5-2: Charakteristische Daten der Duplexe DNA34-35 bis DNA34-39. 2.5 µM DNA, 10 mM NaP_i, pH 7, 250 mM NaCl, λ_exc = 490 nm, 20 °C.

DNA FI_max/nm R_FI (FI_533nm/FI_585nm)

DNA34-35 541 1.40

DNA34-36 535 1.63

DNA34-37 538 1.57

DNA34-38 542 1.33

DNA34-39 543 1.28

DNA40-39 535 1.82