Simultane HLA-allospezifische Stimulation und Depletion durch

Nachdem gezeigt wurde, dass C1R-A1-CD95L in Jurkatzellen effektiv Apoptose induzierten, wurden sie in der gemischten Lymphozytenkultur als Stimulatoren und zugleich Apoptoseinduktoren verwendet. In den Primär- und Restimulationskulturen mit C1R-A1-CD95L konnte sowohl eine erhöhte Apoptoserate der CD4+ und CD8+ Zellen, als auch eine Abnahme der Aktivierungsmarker gezeigt werden.

Allospezifische T-Zell-Depletion wurde durch die Verwendung von C1R-A1-GFP Zellen für die Restimulation nachgewiesen: auch in Abwesenheit CD95L-exprimierender Zellen bei der Restimulation war die Proliferation der primär mit C1R-A1-CD95L stimulierten Zellen komplett inhibiert. Die Kontrollstimulation (OKT3/CD28) mit normalen Proliferationswerten schloss aus, dass die Inhibition der allospezifischen Antwort auf eine Zellschädigung zurückzuführen war.

Zudem konnte gezeigt werden, dass auch keine spezifische Zytotoxizität der allo-depletierten Zellen gegen A1-GFP nach Primärstimulation mit C1R-A1-CD95L detektiert werden konnte.

In einer Vielzahl von Publikationen wurden Ansätze zur Immunmodulation mit Hilfe des CD95/CD95L Systems beschrieben. Die meisten dieser Arbeiten beschäftigten sich mit der Induktion von Toleranz in Organ-Transplantations- und/oder Autoimmun-Modellen in murinen Systemen. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression von CD95L auf allogenen Zellen unterschiedlicher Herkunft (u.a. dendritische Zellen, Makrophagen, Myoblasten, B-Zellen, Knochenmark-Zellen, Colon-Carcinom-Zellen, Thyroidea-Follikelzellen) HLA-allospezifische Antworten inhibieren und Toleranz induzieren können (Lau et al.

1996, Zhang et al. 1998,1999, Matsue et al. 1999, 2001, Min et al. 2000,

Georgantas et al. 2000, Wu et al. 2001, Tourneur et al. 2001, Fleck et al. 2001, Whartenby et al. 2002, Kosiewicz et al. 2002, Wolfe et al. 2002, Ichim et al.

2003, Hoves et al. 2003, 2004).

Trotz dieser Berichte über erfolgreiche Toleranzinduktion, zeigten andere Arbeiten nach Inokulation CD95L-exprimierender Gewebezellen im Tierexperiment eine starke Immunreaktion unter Beteiligung neutrophiler Granulozyten und die daraus resultierende Zerstörung der Transplantate, wodurch die Verwendung CD95L exprimierender Zellen in vivo limitiert ist (Allison et al. 1997, Kang et al. 1997, Takeuchi et al. 1999, Buonocore et al.

2003).

Dennoch blieb CD95L-vermittelte Apoptose attraktiv für die Anwendung in einem in vitro System. So nutzten wie wir mehrere Arbeitsgruppen die Induktion von Apoptose über den CD95/CD95L Weg in vitro zur Inhibition alloantigen-spezifischer Immunantwort und GvHD:

Der Einsatz von Antikörpern und chimären Proteinen gegen CD95 führte in murinen (Miwa et al. 1999, Hartwig et al. 2002, Georgantas et al. 2006) und humanen (O´Flaherty et al. 1998, Huang et al. 2001, Dranitzki Elhalel et al.

2003) Studien zwar zur Reduktion alloreaktiver T-Zellen, in keiner dieser Arbeiten wurde jedoch eine komplette Inhibition der allospezifischen Antwort erreicht. Dies entsprach den Erfahrungen unserer eigenen Gruppe: eine effektive Reduktion alloreaktiver T-Zellen ließ sich mit anti-CD95 nicht erzielen (nicht gezeigt).

Studien, in denen humane Zellen mit humaner CD95L DNA transfiziert wurden, um simultan zu stimulieren und Apoptose zu induzieren, wurde von Dulat und Mitarbeitern 2001 und aus unserem Labor (Strauß et al. 2007) veröffentlicht.

In der Studie von Dulat wurde die embryonale Nieren Zell-Linie 293 mit CD95L transfiziert, um cytotoxische T-Zellen nach allogener Stimulation (7d) mit CD95L⁺ Stimulatoren zu untersuchen und die Frage zu klären, ob eine CD95L Expression die Zellen gegen die Cytolyse durch cytotoxische Effektor-T-Zellen, dem sogenannten Counter-Attack, schützen kann. Es wurde eine reduzierte cytotoxische Aktivität der Zellen nach Stimulation mit CD95L exprimierenden 293 Zellen und eine Resistenz der CD95L⁺ Targets gegen Cytolyse durch Effektor-T-Zellen gefunden. Die Immunantwort bei Restimulation nach CD95L Exposition war in dieser Arbeit allerdings insgesamt, und nicht allospezifisch inhibiert – auch wenn mit 3^rd-party Zellen restimuliert wurde, war die Reaktivität

gering. Eine Erklärung hierfür ist die fehlende Expression costimulatorischer Moleküle auf 293-Zellen, wodurch eine Anergie der T-Helfer Zellen induziert worden sein könnte.

Strauß et al. transfizierten die in dieser Arbeit vorgestellten apoptoseresistenten C1R- und C1R-A1 Zellen mit membranständigem CD95L und untersuchten die Wirkung dieser Zellen in Langzeitstimulationskulturen. Hier wurde eine fehlende Entwicklung cytotoxischer Effektorzellen und eine komplette Inhibition cytotoxischer Aktivität nach 5 Wochen Stimulation mit C1R.A1.CD95L gefunden. Außerdem war nach 2 Wochen Stimulation mit C1R.A1.CD95L die allospezifische Proliferation deutlich reduziert und nach 4 Wochen auf Mediumwerte herabgesetzt, während Immunantworten auf 3^rd-party Zellen und bakterielle bzw. virale Antigene erhalten blieben.

Im Vergleich zu dieser Arbeit fanden wir bereits nach Kurzzeitstimulation von 5 Tagen eine effektive Elimination der cytotoxischen und proliferativen Antwort.

Eine mögliche Erklärung für die höhere Effektivität unseres Systems könnte in der höheren Konzentration von Stimulatorzellen liegen. Im Vergleich einer T-Zell:Stimulator Ratio von 10:1 in der Arbeit von G. Strauß setzten wir eine Konzentration von 2-3:1 ein. Hierdurch erreichten wir eine maximale Stimulation der T-Zellen, was wiederum zu einer hohen Apoptosesensitivität führte. Eigene Experimente mit einer suboptimalen Aktivierungsrate gingen erwartungsgemäß mit einer nicht effizienten Apoptoseinduktion einher (nicht gezeigt). Durch die hohe Konzentration CD95L exprimierender Zellen war zudem eine maximale Depletion aktivierter, apoptosesensitiver CD95⁺ T-Zellen gewährleistet.

Membranständige CD95L-Expression, für welche die effektivste Apoptoseinduktion beschrieben ist (Suda et al. 1997, Tanaka et al. 1998), konnte in mehr als 70% der transduzierten C1R-A1-Zellen nachgewiesen werden. Von den Zellen ins Medium freigesetzter sCD95L könnte außerdem durch eine proapototische Wirkung zur Depletion aktivierter T-Zellen beigetragen haben (Askenasy et al. 2005).

Zusammengefasst ist davon auszugehen, dass sowohl die Wahl der Antigen-präsentierenden Zellen mit optimalen stimulatorischen und costimulatorischen Eigenschaften, als auch das Verhältnis CD95L exprimierender APC / T-Zellen für eine effektive Stimulation und Apoptoseinduktion von großer Bedeutung ist.

4.3.1.1 Unspezifische Apoptoseinduktion durch C1R-/C1R-A1-CD95L

Ein Nachteil der hohen cytotoxischen Wirkung von C1R-A1-CD95L war der sogenannte Bystandereffekt: auch nicht aktivierte T-Zellen wurden eliminert, was zu einem geringen Ertrag viabler T-Zellen nach Kultur mit CD95L exprimierenden Stimulatorzellen führte. Dies stand im Widerspruch zu der Annahme, dass ausschließlich aktivierte humane T-Zellen nach einigen Tagen Apoptosesensitivität erlangen (Owen-Schaub et al. 1992, Klas et al. 1993, Krüger et al. 2003).

Für murine naive Zellen ist eine Sensitivität gegenüber CD95 vermittelter Apoptose beschrieben (Suda et al. 1996). Hier wurde postuliert, dass die Aktivierung von T-Zellen zunächst zu Apoptoseresistenz der Zellen führt, während naive „Bystander“ T-Zellen apoptosesensitiv bleiben. Durch Apoptoseresistenz bei gleichzeitiger, aktivierungsinduzierter Expression von CD95L können aktivierte T-Zellen in Bystanderzellen Apoptose induzieren.

Im Gegensatz zum murinen System erbrachte die Untersuchung humaner Zellen durch die gleiche Arbeitsgruppe (Suda et al. 1997) das Ergebnis, dass humane, frisch isolierte PBL resistent gegen löslichen CD95L und CD95-AK waren, membranständig CD95L exprimierende Zellen jedoch Apoptose induzieren konnten. Da naive T-Zellen im Gegensatz zu Memory-T-Zellen keinen CD95-Rezeptor exprimierten (Miyawaki et al. 1992), folgerten Suda und Mitarbeiter, dass naive Zellen weder durch löslichen noch durch membranständigen CD95L getötet werden können, zeigten aber, dass naive Nabelschnur-T-Zellen durch unspezifische IFN-γ und anti-CD28 Stimulation schnell CD95 exprimieren und Apoptosesensitivität erlangen. Auf die Frage, welchen Sinn die Apoptosesensitivität dieser potentiell nützlichen Zellpopulation haben könnte, wurde postuliert, dass naive oder Memory-Bystander Zellen, die durch Cytokine und Costimulatoren unspezifisch mit stimuliert würden, auf diesem Wege eliminiert werden könnten.

Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen fanden Inaba und Mitarbeiter 1999 murine naive Zellen apoptose-sensibel, während ruhende, antigenspezifische Memory-Zellen eine höhere Resistenz für CD95-AK induzierte Apoptose aufwiesen. In dieser Arbeit wurde CD95 Antikörper zur Apoptoseinduktion verwendet.

Die widersprüchlichen Resultate der unterschiedlichen Gruppen bezüglich der Apoptosesensitivität nicht aktivierter T-Zellen resultieren wahrscheinlich aus

den unterschiedlichen Methoden der Aktivierung (polyklonal/spezifisch) und Apoptoseinduktion (CD95 Antikörper, löslicher CD95L, membrangebundener CD95L).

In unseren Experimenten waren Nabelschnur-MNC resistent gegen C1R-/C1R-A1-CD95L vermittelte Apoptose, während wir Sensitivität in frisch isolierten, adulten MNC fanden, die allerdings deutlich unter der aktivierter T-Zellen lag.

Dies führte wahrscheinlich zu der geringen Zellausbeute in unseren Allodepletions-Ansätzen. Gleichwohl blieb in den Proliferationsassays die Antwort auf OKT3/CD28 und damit die Funktionalität der T-Zellen nach CD95L Exposition erhalten. Ob die überlebende Zellpopulation vorwiegend naiven oder Memory-T-Zellen zuzuordnen ist, bleibt noch zu klären. Wenn die Beobachtung von Inaba et al. auch für unser System zuträfe, wären von der unspezifischen Apoptoseinduktion v.a. naive T-Zellen betroffen, während antigenspezifische Memory-Zellen erhalten blieben. Dies wäre für die Vorbereitung einer klinischen Anwendung von Vorteil, da vorwiegend naive T-Zellen im Empfänger GvHD verursachen, während Memory-T-Zellen einer allospezifischen Aktivierung nicht zugänglich sein sollten.

Für die Vorbereitung auf eine klinische Anwendung könnte eventuell durch Titrationsversuche die Stimulatoren/Responder Ratio weiter optimiert werden, so dass eine minimale unspezifische Apoptoseinduktion einer ausreichenden Effizienz allospezifischer Depletion gegenübersteht.

4.3.2 Sequentielle HLA-allospezifische Depletion durch CD95L