Sequentielle HLA-allospezifische Depletion durch CD95L

den unterschiedlichen Methoden der Aktivierung (polyklonal/spezifisch) und Apoptoseinduktion (CD95 Antikörper, löslicher CD95L, membrangebundener CD95L).

In unseren Experimenten waren Nabelschnur-MNC resistent gegen C1R-/C1R-A1-CD95L vermittelte Apoptose, während wir Sensitivität in frisch isolierten, adulten MNC fanden, die allerdings deutlich unter der aktivierter T-Zellen lag.

Dies führte wahrscheinlich zu der geringen Zellausbeute in unseren Allodepletions-Ansätzen. Gleichwohl blieb in den Proliferationsassays die Antwort auf OKT3/CD28 und damit die Funktionalität der T-Zellen nach CD95L Exposition erhalten. Ob die überlebende Zellpopulation vorwiegend naiven oder Memory-T-Zellen zuzuordnen ist, bleibt noch zu klären. Wenn die Beobachtung von Inaba et al. auch für unser System zuträfe, wären von der unspezifischen Apoptoseinduktion v.a. naive T-Zellen betroffen, während antigenspezifische Memory-Zellen erhalten blieben. Dies wäre für die Vorbereitung einer klinischen Anwendung von Vorteil, da vorwiegend naive T-Zellen im Empfänger GvHD verursachen, während Memory-T-Zellen einer allospezifischen Aktivierung nicht zugänglich sein sollten.

Für die Vorbereitung auf eine klinische Anwendung könnte eventuell durch Titrationsversuche die Stimulatoren/Responder Ratio weiter optimiert werden, so dass eine minimale unspezifische Apoptoseinduktion einer ausreichenden Effizienz allospezifischer Depletion gegenübersteht.

4.3.2 Sequentielle HLA-allospezifische Depletion durch CD95L

Daher wurden CD95L exprimierende Zellen als Apoptoseinduktor nach HLA-spezifischer Aktivierung durch („empfängerspezifische“) Zellen eingesetzt: die Aktivierung erfolgte durch EBV-B-Zellen, die Apoptoseinduktion durch C1R-A1-CD95L oder Fib-C1R-A1-CD95L. Aktivierung und Apoptoseinduktion fanden hierbei nicht gleichzeitig, sondern sequentiell statt. Das sequentielle System wurde deshalb gewählt, weil bei gleichzeitiger Zugabe von EBV-B-Zellen und CD95L exprimierenden Apoptoseinduktoren zum einen in den CD95-sensitiven EBV-Stimulatoren Apoptose induziert würde, zum anderen evtl. durch sterische Gegebenheiten eine effektive Aktivierung bzw. Apoptoseinduktion der T-Zellen nicht gewährleistet wäre.

4.3.2.1 Sequentielles Depletionssystem unter Beibehaltung von HLA-Identität von Stimulatoren (EBV-B-Zellen) und Apoptoseinduktoren (CD95L transduzierte Fibroblasten)

In unserem ersten sequentiellen System war HLA-Identität der Stimulatoren und Apoptoseinduktoren gegeben: die Stimulation erfolgte durch EBV-B-Zellen und nachfolgend die Apoptoseinduktion durch CD95L-transduzierte Fibroblasten (Fib-CD95L) des gleichen Spenders.

Unter Verwendung von Fib-CD95L wurde eine erhöhte Apoptoserate der T-Zellen und eine geringere Expression von Aktivierungsmarkern gefunden. Die allospezifische Proliferation und Zytotoxizität war reduziert. Dabei war die Effektivität - wahrscheinlich durch die geringe Oberflächenexpression von CD95L auf den transduzierten Fibroblasten - geringer als im simultanen System mit C1R-A1-CD95L. Prinzipiell konnten wir hier jedoch zeigen, dass Apoptoseinduktion im sequentiellen System möglich war.

4.3.2.2 HLA-allospezifische Depletion durch CD95L transduzierte C1R-A1-Zellen nach sequentieller Stimulation/Apoptoseinduktion

Da die Effektivität der Allodepletion durch Fib-CD95L nicht zufriedenstellend war, wurden in einem sequentiellen System C1R-CD95L und C1R-A1-CD95L zur Apoptoseinduktion eingesetzt. Diese Zellen wiesen im Gegensatz zu den transduzierten Fibroblasten eine hohe membranständige CD95L Expression auf, so dass eine hohe biologische Aktivität gewährleistet war. Die Primärstimulation wurde mit EBV-B-Zellen durchgeführt, welche zu den Apoptoseinduktoren HLA-different waren. Sowohl CD95L als auch

C1R-A1-CD95L induzierten Apoptose und reduzierten die Expression von Aktivierungsmarkern in allogen stimulierten T-Zellen. Hierbei war die Effektivität von C1R-A1-CD95L höher als die von C1R-CD95L, was durch die allmähliche Abnahme der CD95L Expression im Laufe der Kultur von C1R-CD95L (nicht gezeigt) zu erklären war. Daher wurden für die nachfolgenden Experimente ausschließlich C1R-A1-CD95L verwendet. Sowohl allospezifische Proliferation, als auch Zytotoxizität waren nach sequentieller Stimulation mit EBV-B-Zellen und Apoptoseinduktion durch C1R-A1-CD95L komplett inhibiert, während die Proliferation auf 3^rd-party Zellen normale Werte zeigte.

Nach unserem Wissen konnten wir hier erstmals zeigen, dass eine komplette Inhibition der allospezifischen Proliferation und Zytotoxizität in einem sequentiellen System möglich ist.

In einem ähnlichen Ansatz setzten O´Flaherty und Mitarbeiter (1998) anti CD95-mAK (Klon DX2) und konstitutiv CD95L exprimierende SW20 Coloncarcinom Zellen ein, um nach allogener Stimulation von humanen MNC mit allogenen EBV-B-Zellen Apoptose zu induzieren. Sie konnten maximal eine Reduktion der allospezifischen Proliferation um ca. 45% erreichen, wobei die CD95L exprimierenden SW620 Zellen (selbst bei einem Einsatz von 20:1 SW620:MNC) nicht effektiver waren als CD95-mAK. Mehrere Erklärungen für die geringe Effektivität dieses Systems sind möglich: Die Expression von CD95L auf SW620 wurde mit dem CD95L-Antikörperklon H11 nachgewiesen, der nach unseren Erfahrungen nicht spezifisch für humanen CD95L ist (s.

Anhang). SW620 Zellen wurden zudem nur für 8h mit d7 allo-stimulierten T-Zellen cokultiviert, möglicherweise ein zu kurzer Zeitraum. Dennoch wurde hier prinzipiell demonstriert, dass in T-Zell-Stimulationskulturen sequentiell Apoptose induziert werden kann. Auch in weiteren Arbeiten wurde gezeigt, dass Stimulation und Apoptoseinduktion nicht durch die gleichen Zellen erfolgen muss (Lau et al. 1996, Dulat et al. 2001).

Diese und unsere Ergebnisse stehen im Widerspruch zu einer Studie aus unserem Forschungslabor, in der zur Apoptoseinduktion ebenfalls CD95L exprimierende C1R-/C1R-A1 Zellen verwendet wurden und eine Coexpression von apoptoseinduzierenden m-CD95L und stimulierenden HLA-A1 auf der gleichen APC als unabdingbar für die Vermeidung cytotoxischer Alloreaktivität

gefunden wurde (G. Strauß et al. 2007). Mögliche Erklärungen für diesen Widerspruch liegen im unterschiedlichen experimentellen System: Zum einen setzten wir, wie unter Abschnitt 4.1.5. beschrieben, eine fünffach höhere Anzahl an Stimulatoren ein, um eine maximale Aktivierung und damit Apoptosesensitivität der T-Zellen zu erreichen. Auch die Konzentration der Apoptoseinduktoren in unserem System war fünffach höher. Zum anderen wurden in der genannten Studie (apoptoseresistente) Stimulatoren und Apoptoseinduktoren gleichzeitig und nicht sequentiell angewendet. Dies könnte durch sterische Gegebenheiten eine gezielte Apoptoseinduktion in den aktivierten T-Zellen behindert haben, zumal hier m-CD95L exprimierende C1R-Zellen verwendet wurden und löslicher CD95L nicht vorhanden war, so dass Zell-Zell-Kontakt für die Apoptoseinduktion unerlässlich war. Zuletzt verzichteten wir im Gegensatz zu G.Strauß auf die Zugabe von IL-2 zu den Kulturen und arbeiteten mit CD56/CD16 (NK-Zell-) depletierten MNC. Auf diese Weise verhinderten wir die Proliferation apoptoseresistenter, CD56⁺ cytotoxischer T-Zellklone (Strauß et al. 2003), welche vermutlich NK-T-Zellen zuzuordnen sind (Mittag et al. 2005).

Zusammengefasst erreichten wir im sequentiellen System mit C1R-A1-CD95L Zellen eine mit dem simultanen System vergleichbare, hoch effektive Depletion alloreaktiver Zellen. Wir konnten hier erstmals allospezifische Proliferation und Zytotoxizität humaner T-Zellen durch CD95L exprimierende humane Zellen komplett inhibieren, während die Proliferation auf 3^rd-party Zellen erhalten blieb.

Dieses System ist zudem klinisch praktikabel, da individuell allospezifische Donorzellen nach spezifischer Aktivierung durch Empfänger-Zellen durch eine

„universell“ einsetzbare, CD95L-exprimierende Zelllinie depletiert werden.

4.4 CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺ regulatorische T-Zellen in CD95L- Allodepletionsmodellen

Einer der Schwerpunkte dieser Arbeit war die Untersuchung CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺ regulatorischer T-Zellen im simultanen und sequentiellen Allodepletionsmodell aus folgenden Gründen:

Zum einen fanden wir nach CD95L-Exposition trotz hoher Allodepletionseffizienz einen relativ hohen Anteil nicht apoptotischer CD4⁺

Zellen, die den Aktivierungsmarker CD25 exprimierten. Das Fehlen alloreaktiver Proliferation und Zytotoxizität ließ uns vermuten, dass die CD25 Expression hier nicht mit dem Aktivierungsstatus der Zellen einher ging, sondern es sich vielmehr um CD25 konstitutiv exprimierender regulatorische T-Zellen handeln könnte.

Zum anderen war in einer Anzahl von Arbeiten im Mausmodell gezeigt worden, dass regulatorische T-Zellen GvHD abschwächen oder sogar verhindern konnten (Cohen et al. 2002, Taylor et al. 2002, Hoffmann et al., 2002, Edinger et al. 2003, Trenado et al. 2003, 2004, Hoffmann und Edinger 2006, Salomon et al. 2006, Bénard et al. 2006). In einer kürzlich veröffentlichten Studie wurde die Korrelation einer niedrigen FoxP3 Expression mit einem verstärkten GvHD Risiko in pädiatrischen Patienten nach Stammzelltransplantation beschrieben (Olkinuora et al. 2007).

Daher untersuchten wir, ob in unseren Systemen CD4+CD25+FoxP3+ Treg

erhalten blieben, und führten sowohl phänotypische als auch funktionelle Analysen durch.

4.4.1 Apoptoseresistenz von Treg im simultanen Allodepletionssystem