Salmonella enteritidis als Antigen

Abb. 3.9 Nachweis von S.enteritidis DNA in murinem Gewebe durch PCR. BALB/c Mäuse wurden intraperitoneal mit 1 ml 2 x 10⁸ inaktivierten Bakterien bzw. S.ent/Maus-anti-S.ent-IgA-Komplexen inokuliert und nach 8 h perfundiert. Die Anzahl der S.ent-Genome in DNA aus Leber, Thymus, Milz, thymusumgebendem Gewebe (TUG), GALT und Blut wurden mit einem Taqman-basierten Real-Time PCR-Assay bestimmt. Jeder Kreis repräsentiert den Messwert einer einzelnen Maus. Horizontale Linien entsprechen den Medianwerten der Gruppen. Ein signifikanter Nachweis von S.ent-DNA erfolgte vor allem im TUG und im GALT wobei die Werte stark streuen und kein generelles Verteilungsmuster nach Verabreichung von freien Bakterien und IgA-Komplexen erkennbar ist.

Die Ergebnisse der intraperitonealen Injektion sind in Abb. 3.9 grafisch dargestellt. Auf den ersten Blick ist auffällig, dass lediglich im TUG und im GALT eine große Anzahl an Genomen nachgewiesen werden konnte. In der Leber dagegen konnten nur sehr geringe Mengen S.ent-DNA nachgewiesen werden. Gleiches gilt ebenfalls für die Milz und das Blut.

Da in diesem Versuch nur 3 Tiere pro Inokulum eingesetzt wurden und die gemessenen S.ent-DNA-Konzentrationen stark streuten, kann keine Aussage getroffen werden, ob die Komplexierung von S.ent mit IgA-Antikörpern zu einer Veränderung der Verteilung im Organismus führt. Was dieser Versuch aber zeigt ist, dass der Nachweis von S.ent-DNA in Maus-Gewebe generell möglich ist und dass sich die Bakterien-DNA im thymusumgebenden Gewebe und GALT nachweisen ließ.

Eine Inhibition der PCR durch Bestandteile der Gewebe ließ sich durch Amplifizierung der 18S rDNA ausschließen, so dass davon ausgegangen werden kann, dass negativ getestete Gewebe tatsächlich keine S.ent-DNA enthielten.

Nach intravenöser Injektion wurden nur in jeweils einem Tier pro Inokulum sehr geringe Mengen an S.ent-DNA lediglich in Leber und Milz nachgewiesen und in dem folgenden Versuch diese Art der Injektion nicht mehr durchgeführt.

3.2.2.2 Nachweis von S.enteritidis in Gewebeschnitten

Neben der PCR als Methode zum Nachweis von S.ent wurde außerdem versucht, die Bakterien über den Nachweis von Oberflächen-Antigenen in Gewebeschnitten von Leber und Thymus nachzuweisen. Der Nachweis im TUG wurde auf Grund der geringen Menge des Materials nicht geführt.

Für die Markierung wurde ein Kaninchen-α-Salmonella O-Antigen-IgG-Antikörper in Kombination mit einem Ziege-anti-Kaninchen Alexa488 konjugiertem Antikörper genutzt. In keinem der Gewebe konnte jedoch eine spezifische Fluoreszenz, die auf ein Vorhandensein von S.ent-Antigenen hingedeutet hätte, detektiert werden.

3.2.2.3 Verteilung von S.enteritidis sowie S.enteritidis/Immunkomplexen im murinen Organismus

Obwohl im Vorexperiment nur kleine Mengen an Bakterien im Blut nachweisbar waren, wurden die Tiere vor der Entnahme der Gewebe ebenfalls perfundiert, um die Vergleichbarkeit mit den Ergebnissen aus dem Vorexperiment (3.2.2.1) zu gewährleisten. Der Versuch wurde analog zu dem in 3.2.2.1 beschrieben Versuch durchgeführt, wobei auf die intravenöse Injektion verzichtet wurde und diesmal auch S.ent/IgG-Komplexe als Inokulum mitgeführt wurden. Pro Inokulum wurden 6 Tiere eingesetzt.

Der Nachweis erfolgte ebenfalls über quantitative PCR. In Abb. 3.10 ist grafisch dargestellt, wie viele Genomkopien jeweils pro Nanogramm Maus-DNA in den einzelnen Geweben detektiert wurden. Wie schon im Vorversuch ließen sich auch hier die meisten Genome im TUG und GALT nachweisen. Aufgrund der großen Streuung ist eine statistische Berechnung der Signifikanz nicht möglich, trotzdem lassen sich bei Betrachtung der Medianwerte der Gruppen Trends erkennen. So ließen sich nach Injektion von freien S.enteritidis Bakterien

Abb. 3.10 Verteilung von S.ent/Immunkomplexen in BALB/c-Mäusen. Pro Inokulum wurden 6 Tiere intraperitoneal mit 1 ml 2 x 10⁸ inaktivierten Bakterien bzw. S.ent/Maus-anti-S.ent-IgA-Komplexen oder S.ent/Maus-anti-S.ent-IgG-Komplexen inokuliert und nach 8 h perfundiert. Die Anzahl der S.ent Genome in DNA aus Leber, Thymus, Milz, thymusumgebendem Gewebe (TUG), GALT und Blut wurden mit einem Taqman-basierten Real-Time PCR-Assay bestimmt. Jeder Kreis repräsentiert den Messwert einer einzelnen Maus. Horizontale Linien entsprechen den Medianwerten der Gruppen. Im TUG und GALT konnten hohe Mengen an S.ent-DNA detektiert werden. Insgesamt war die Menge an detektierter S.ent-DNA nach Verabreichung von S.ent/IgA-Komplexen in diesen Geweben geringer als nach Gabe von freien Bakterien oder IgG-Komplexen. In den Thymi wurde keine S.ent-DNA nachgewiesen.

mehr Genomkopien im TUG und GALT nachweisen als bei Verabreichung der Bakterien als Immunkomplexe, wobei auch beim Vergleich der Gruppen, denen IgA- oder IgG-Komplexe injiziert wurden, ein Unterschied auszumachen ist. So ließen sich in den Tieren, denen mit IgG komplexierte Bakterien verabreicht wurden, mehr S.ent-Genome im TUG und GALT nachweisen als in den Tieren, die mit IgA-Immunkomplexen behandelt wurden.

Wird davon ausgegangen, dass die Anzahl der nachgewiesenen Genome mit der Anzahl intakt vorliegender Bakterien gleichgesetzt werden kann, so ist dieses Verteilungsmuster dadurch zu erklären, dass die durch Antikörper gebundenen Bakterien schneller durch Zellen des Immunsystems aufgenommen und abgebaut werden.

Abb. 3.11 Verteilung von S.ent/Immunkomplexen im murinen Organismus. BALB/c Mäuse wurden intraperitoneal mit 1 ml 2 x 10⁸ inaktivierten Bakterien (n = 9) bzw. S.ent/IgA-Komplexen (n = 9) oder S.ent/IgG-Komplexen (n = 6) inokuliert und nach 8 h perfundiert. Dargestellt ist die Anzahl der S.ent-Genome in DNA aus Leber, Thymus und thymusumgebendem Gewebe (TUG). Jeder Kreis repräsentiert den Messwert einer einzelnen Maus. Horizontale Linien entsprechen den Medianwerten der Gruppen. Die Zusammenfassung zeigt dass in der Leber nach Inokulation geringe Mengen S.ent-DNA nachgewiesen werden konnten, nicht aber im Thymus. Im TUG konnten hohe Mengen an S.ent-DNA detektiert werden, wobei die Menge im Mittel nach Verabreichung von S.ent/IgA-Komplexen geringer war als nach Gabe von freien Bakterien oder IgG-Komplexen.

In Abb. 3.11 sind die Ergebnisse aus Versuch 3.2.2.1 und 3.2.2.3, die mit dem Thymus, der Leber und dem TUG erhaltenen wurden, zusammenfassend dargestellt. Es zeigt sich deutlich, dass die nachgewiesenen Mengen an S.ent-DNA in Leber und TUG nach Verabreichung von IgA-Komplexen am geringsten war. Außerdem ist noch einmal deutlich zu erkennen, dass in keinem der Thymi S.ent-DNA nachgewiesen werden konnte.