P ROTEINCHEMISCHE M ETHODEN

4.7.1 Proteinextraktion aus Hefezellen

Um Proteine aus Hefezellen zu gewinnen, wurden nach PRINTEN und SPRAGUE (1994) vorgegangen. Mit den Zellen einer 5 ml Übernachtkultur in Selektionsmedium wurde eine 50 ml YPDA-Kultur angeimpft.

Diese wurde bis zu einer OD600 von 0,5-0,8 unter Schütteln inkubiert. Die Kultur wurde zur Hälfte in einen mit Eis gefüllten Zentrifugenbecher gegossen und 5 min bei 3000 g zentrifugiert. Nachdem der Zellniederschlag mit 50 ml H2O gewaschen war, wurde er resuspendiert und in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt, das mit flüssigem Stickstoff übergossen wurde. Der Zellniederschlag konnte nun eingefroren und bei -70°C gelagert oder sofort weiterverarbeitet werden. Zum Aufschluss der Zellen wurden sie in 400 µl, auf 60°C vorgewärmtem, Aufschlusspuffer (8 M Harnstoff, 5 % (w/v) SDS, 40 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,1 mM EDTA, 0,4 mg/ml Bromphenolblau, 1 % (v/v) β-Mercaptoethanol, 875 µg/ml PMSF, 7 µg/ml Pepstatin A, 2 µM Leupeptin, 10 mM Benzamidin) suspendiert und 10 min bei 70°C inkubiert. Nach Zugabe von 300 mg Glasperlen erfolgte das Aufbrechen der Zellen durch einminütiges Schütteln auf dem Vortex-Mischer. Der flüssige Überstand (10 µl) konnte direkt zur gelelektrophoretischen Analyse verwendet werden.

4.7.2 Denaturierte Gesamtzellextrakte aus Tabakblättern

Um denaturierte Gesamtzellextrakte für die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zu erhalten, wurden die zu analysierenden Tabakblätter unter flüssigem Stickstoff zu feinem Pulver gemörsert und in ein Reaktionsgefäß überführt. Das Material wurde mit der dreifachen Menge (mg = µl) Extraktionspuffer (4 M Harnstoff, 16,6 % (v/v) Glycerin, 5 % (v/v) β-Mercaptoethanol, 5 % (w/v) SDS, 0,5 % (w/v) Bromphenolblau) gründlich gemischt und für 10 min bei 65°C unter Schütteln inkubiert. Die Abtrennung unlöslicher Zellbestandteile erfolgte durch Zentrifugation bei 13.000 rpm für 20 min bei RT in einer Tischzentrifuge. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und bei -80°C gelagert. Eine Proteinbestimmung konnte aufgrund der Zusammensetzung des Extraktionspuffers nicht vorgenommen werden. Die Abschätzung relativer Proteinmengen in verschiedenen Ansätzen erfolgte über die densiometrische Auswertung eines mit Coomassie Brilliant Blue G-250 gefärbten SDS-Polyacrylamidgels (Kapitel 4.7.8). Für dieses Abgleichgel wurden jeweils 5 µl der Proteinpräparation elektrophoretisch aufgetrennt.

4.7.3 Native Gesamtzellextrakte aus Tabakblättern

Um native Gesamtzellextrakte für Gelretardationsexperimente (Kapitel 4.7.7) zu erhalten, wurden die zu analysierenden Tabakblätter unter flüssigem Stickstoff zu feinem Pulver gemörsert und in ein Reaktionsgefäß überführt. Auf das Material wurde die zweifache Menge (mg = µl) vorgekühlten Extraktionspuffers (50 mM Hepes pH 7,5, 20 mM KCl, 2,5 mM DTT, 2 mM EGTA, 50 µg/ml Antipain, 2 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Chymostatin, 5 µg/ml E-64, 0,5 µg/ml Leupeptin, 1 mg/ml Pefabloc) gegeben. Das Mischen des Ansatzes erfolgte solange bis dieser vollständig aufgetaut war. Diese Arbeiten erfolgten im Kühlraum, um selbst partielle Erwärmungen des Pflanzenmaterials zu vermeiden. Bei dem anschließenden Zentrifugationsschritt mit 15.000 rpm bei 4°C für 10 min (Eppendorf-Kühlzentrifuge)

wurden die nichtlöslichen Zelltrümmer pelletiert und der Überstand als Proteinlösung gewonnen. Die Konzentrationsbestimmung der Proben erfolgte nach der Methode von BRADFORD (Kapitel 4.7.5). Man erhält Proteinkonzentrationen von 1-2 µg/µl. Nachdem die Proben aliquotiert worden waren, konnten sie bis zur Verwendung bei -80°C aufbewahrt werden.

4.7.4 Kernproteinextrakte

Für die Isolierung von Kernproteinextrakten wurde stets frisches Blattmaterial verwendet, d. h. dass die Proben entweder sofort aufgearbeitet oder kurzfristig in flüssigem Stickstoff gelagert wurden.

Die Methoden von KEGLER (2001) wurden teilweise modifiziert. Alle Arbeitsschritte wurden im Kühlraum durchgeführt.

Unter flüssigem Stickstoff wurden 10 g Blattmaterial, aus dem die Mittelrippe entfernt worden ist, mit einem elektrischen Schermixer (Kaffeemühle) zu feinem Pulver zermahlen und in 40 ml Puffer 1A (1 M Hexylenglycol, 0,25 M Saccharose, 20 mM TAPS pH 8,5, 10 mM MgCl2, 0,15 mM Spermin, 0,5 mM Spermindin, 0,6 % Nonidet P-40, 80 mM β-Mercaptoethanol) aufgenommen. Die anschließende Filtration durch zwei Lagen Miracloth trennte die verbliebenden größeren Zelltrümmer von der Suspension mit den Organellen ab. Im folgenden Zentrifugationsschritt (SS34, 1000 rpm, 4°C, 2 min 40s) wurden kleinere Zelltrümmer und Stärke von den in der Lösung verbliebenen Organellen separiert. Die Suspension wurde einer weiteren Zentrifugation zur Pelletierung der Zellkerne unterzogen (SS34, 2000 rpm, 4°C, 3 min) und der Überstand verworfen. Zur Entfernung von Chloroplasten wurde das Pellet anschließend dreimal gewaschen, indem es zunächst mit Hilfe eines feinen Haarpinsels in 8 ml Puffer 0,5A (0,5 M Hexylenglycol, 0,25 M Saccharose, 20 mM TAPS pH 8,5, 10 mM MgCl2, 0,15 mM Spermin, 0,5 mM Spermidin, 0,6 % Nonidet P-40, 80 mM β-Mercaptoethanol) resuspendiert und die Suspension anschließend zentrifugiert wurde (SS34, 2000 rpm, 4°C, 5 min). Das Protokoll wurde auf zwei Arten weitergeführt.

4.7.4.1 Denaturierte Kernproteinextrakte

Das bei der Herstellung erhaltene Pellet wurde in 400 µl Harnstoffpuffer (4 M Harnstoff, 16,66 % (v/v) Glycerin, 5 % (w/v) SDS, 5 % (w/v) β-Mercaptoethanol) aufgenommen und für 20 min bei 65°C inkubiert. Eine anschließende Ultraschallbehandlung fragmentierte die DNA und hob somit den viskosen Charakter der denaturierten Proteinlösung auf. Abschließend wurde die Mischung bei RT für 30 min in einer Tischzentrifuge bei 13.000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und bei -80°C gelagert. Eine Proteinbestimmung konnte aufgrund der Zusammensetzung des Extraktionspuffers nicht vorgenommen werden. Die Abschätzung relativer Proteinmengen in verschiedenen Ansätzen erfolgte über die densiometrische Auswertung eines mit Coomassie Brilliant Blue G-250 gefärbten SDS-Polyacrylamidgels (Kapitel 4.7.8). Für dieses Abgleichgel wurden jeweils 5 µl der Proteinpräparation elektrophoretisch aufgetrennt.

4.7.4.2 Native Kernproteinextrakte

Alle Arbeitsschritte wurden bei 4°C durchgeführt. Das Pellet wurde in 4 ml Lysispuffer (110 mM KCl, 15 mM Hepes pH 7,6, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,2 mM PMSF, 50 µg/ml Antipain, 2 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Chymostatin, 5 µg/ml E-64, 0,5 µg/ml Leupeptin, 1 mg/ml Pefabloc) aufgenommen und die chromosomale DNA im Homogenisator geschert. Die Zugabe von 1/9 Volumen 4 M Ammoniumsulfat erfolgte unter langsamem Rühren. Nach 1 h bei 4°C wurde die Kernmembran durch Zentrifugation (SS34, 30 min, 16.000 rpm, 4°C) von der flüssigen Phase getrennt. Zur Pelletierung der chromosomalen DNA wurde der Überstand sofort ultrazentrifugiert (TFT 65.13, 2 h, 55.000 rpm, 4°C) und sofort in ein Becherglas überführt und die Kernproteine durch Zugabe von 0,37 g/ml gemörsertem Ammoniumsulfat über Nacht gefällt (langsam Rühren).

Die Kernproteine wurden durch Zentrifugation (SS34, 30 min, 16.000 rpm, 4°C) pelletiert. Das Pellet wurde in Dialysepuffer (100 mM KCl, 20 mM Hepes pH 7,6, 0,2 mM EDTA, 10 % (v/v) Glycerin,

0,5 mM DTT, 0,2 mM PMSF)versetzt, mit Proteaseinhibitoren (50 µg/ml Antipain, 2 µg/ml Aprotinin, 10 µg/ml Chymostatin, 5 µg/ml E-64, 0,5 µg/ml Leupeptin, 1 mg/ml Pefabloc) aufgenommen und die Lösung gegen zweimal Dialysepuffer dialysiert. Der Proteingehalt der Proben wurde mit der Methode nach BRADFORD bestimmt (4.7.5). Die zu erwartenden Proteinmengen liegen zwischen 1-1,5 µg/µl. Die Proben wurden anschließend aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert.

4.7.5 Konzentrationsbestimmung von Proteinextrakten

Die Bestimmung der Proteinkonzentration nach BRADFORD (1976) beruht auf der Verschiebung des Absoprtionsmaximums von Coomassie Brilliant Blue G-250 (von 465 nm zu 595 nm) nach Bindung an ein Protein. Eine adäquate Menge des Proteinextraktes wurde in die Vertiefung („well“) einer 96-„well“-Mikrotiterplatte vorgelegt und mit 200 µl verdünnten (1:5 mit H2O) Bradford-Reagenz (Roth) vermischt.

Nach 5-minütiger Inkubation konnte die optische Dichte bei 595 nm im Spektralphotometer (MRX Dynex Plate Reader) bestimmt werden. Die Proteinkonzentration wurde anhand einer mit BSA-Standards (1 µg, 3 µg, 6 µg) erstellten Eichgerade ermittelt.

4.7.6 Affinitätsaufreinigung des Antiserums

Die Methode der Affinitätsaufreinigung von polyklonalen Antiseren nach OLMSTED (1981) stellt eine Modifikation des Western-Blots (4.7.10) dar. Hierzu wurde das aus der Affinitätschromatographie resultierende Fusionsprotein in einem präparativen 10 %-igen (w/v) SDS-Gel (Kapitel 4.7.8) aufgetrennt.

Das Volumen des Eluats wurde so gewählt, dass ca. 1 mg des Fusionsproteins darin enthalten waren. Die Proteine wurden anschließend mittels Semi-Dry-Blot (Kapitel 4.7.10.1) auf eine PVDF-Membran transferiert. Nach dem Anfärben der Membran mit Ponceau-Lösung (0,1% (w/v) Ponceau S, 5 % (v/v) Essigsäure) wurde die Bande mit dem Fusionsprotein ausgeschnitten und in ca.

3 x 3 mm große Stücke zerteilt. Die Membranstücke wurden mit 10 ml 5 % (w/v) Magermilch in PBS-T (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 4,0 mM Na2HPO4, pH 7,4 mit 0,05 % TWEEN 20) über Nacht bei 4°C inkubiert und anschließend 5 min in 10 ml PBS-T bei RT gewaschen. 2 ml des entsprechenden polyklonalen Antiserums wurden mit PBS (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 4,0 mM Na2HPO4, pH 7,4) auf 10 ml aufgefüllt und die PVDF-Stückchen 2-3 h mit der Antikörperlösung inkubiert. Unspezifische gebundene Antikörper wurden durch Waschen mit 10 ml PBS-T für 6 x 15 min entfernt. Im Anschluß wurden die spezifischen Antikörper mit 0,1 M Glycin pH 2,5 von der Membran eluiert. Die Elution wurde möglichst schnell durchgeführt und die Eluate sofort neutralisiert, um eine Schädigung der Antikörper zu vermeiden. Hierzu wurden 4 x je 1 ml Neutralisierungslösung (0,3 ml 1M Tris-HCl pH 8 mit 0,7 ml PBS) auf Eis bereitgehalten. Zur Elution wurden 2 ml 0,1 M Glycin pH 2,5 auf die Membranstücke gegeben, diese exakt 30 s unter Invertieren mit der Lösung inkubiert und die Lösung unmittelbar im Anschluß in die Neutralisierungslösung überführt.

Die Elution wurde unter gleichen Bedingungen dreimal wiederholt. Die Eluate mit den spezifischen Antikörpern wurden danach in Centricon 10-Säulen mit 2 x 2 ml PBS mit 0,02 % (v/v) Natriumazid umgepuffert und aufkonzentriert. Zu den Antiseren wurde BSA mit einer Endkonzentration von 5 % gegeben. Danach konnten diese bei -20°C gelagert werden. Die Qualität der affinitätsaufgereinigten Antikörpern wurde mittels Western-Blot-Analyse (4.7.10) mit denaturierten Gesamtzellextrakten (Kapitel 4.7.2) getestet.

4.7.7 Gelretardationsanalysen (EMSA)

DNA-Fragmente, an die Proteine binden, zeigen in einem nativen Polyacrylamidgel ein anderes Laufverhalten als ungebundene DNA. Der Protein-DNA-Komplex wandert aufgrund seines höheren Molekulargewichts weniger weit, verglichen mit dem proteinfreien Fragment. Diese Verzögerung im Laufverhalten wird als Retardierung oder „shift“ bezeichnet. Man macht sich das Phänomen in Gelretardationsanalysen (Electrophoretic Mobility Shift Assay = EMSA) zunutze, um die spezifische Bindung von Proteinen an bestimmte DNA-Sequenzen nachzuweisen. Hierzu wird das entsprechende DNA-Fragment radioaktiv markiert und in einem geeigneten Puffer mit einem Proteinextrakt inkubiert.

Nach Gelelektrophorese und Autoradiographie des Gels kann aus dem auftretenden Bandenmuster auf eine eventuelle Interaktion von Proteinen und DNA geschlossen werden.

Eine Variante der Gelretardationsanalyse ist der Supershiftassay, bei dem zusätzlich ein spezifischer Antikörper in den Bindeansatz gegeben wird. Erkennt dieser Antikörper Proteine, die Bestandteile des Protein-DNA-Komplexes sind, so bewirkt seine Bindung an diese Proteine eine weitere Retardierung des Komplexes („Supershift“).

Für dieses Assay wurden 2 µg native Kernproteinextrakte (Kapitel 4.7.4.1) und 20 µg native Gesamtzellextrakte (Kapitel 4.7.3) verwendet. Die Bindereaktion erfolgte in einem Gesamtvolumen von 30 µl in 1 x Bindepuffer (25 mM Hepes pH 7,6, 10 mM MgCl2, 0,2 mM CaCl2, 0,2 mM DTT, 0,4 mM PMSF 10 % (v/v) Glycerin). Die Proteinproben wurden in Gegenwart von 3 µg polydI/dC (als Kompetitor für unspezische DNA-Bindeproteine) für 10 min auf Eis vorinkubiert. Bei Supershiftassays wurde zusätzlich jeweils 1 µl des entsprechenden Antiserums in die Ansätze pipettiert. Nach Zugabe von 4 µl radioaktiv markiertem DNA-Fragment (Kapitel 4.5.12.1) pro Ansatz folgte eine zehnminütige Inkubation bei Raumtemperatur. Die Proben wurden anschließend mit jeweils 10 µl Auftragspuffer (50 % (v/v) Glycerin, 42 % (v/v) 5 x Bindepuffer: 125 mM Hepes pH 7,6, 50 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 5 mM DTT, 2 mM PMSF, 50 % (v/v) Glycerin) versetzt und in einem nativen, 5 %-igem Polyacrylamidgel (Kapitel 4.5.6.2) bei 4°C gelelektrophoretisch aufgetrennt. Das Gel war mindestens eine Stunde bei 150 V vorgelaufen. Die Elektrophorese der Proben erfolgte bei 65 V. Für die Autoradiographie wurde das Gel auf Fließpapier transferiert und unter Haushaltsfolie 2 h bei 80°C auf einem Vakuumgeltrockner getrocknet. Nach mindestens vier Stunden Exposition auf einem IP-Screen erfolgte die Detektion der Signale im Bioimager (BAS-1000 von Fuji). Für die Auswertung wurden die Programme PCBAS^®2.09 und TINA^®2.0 der Firma raytest Isotopenmeßgeräte verwendet.

4.7.8 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Bei der diskontinuierlichen SDS-Polyacrylamid-Gelelektrrphorese (SDS-DISKPAGE) werden Proteine unter denaturierenden Bedingungen in einem aus Sammel- und Trenngel bestehenden Polyacrylamidgel der Größe nach aufgetrennt (modifiziert nach LAEMMLI, 1970). In dieser Arbeit wurden große Vertikalgele (Trenngelgröße 18 cm x 7 cm, 22 Taschen, Eigenbau der Werkstatt) verwendet. Die Trenngele setzen sich aus 10 % (w/v) Acrylamid: N,N´-Methylenbisacrylamid (19:1) , 0,4 M Tris-HCl pH 8,8, 0,1 % (w/v) SDS, 0,1 % (v/v) TEMED und 0,1 % (w/v) APS. Die Sammelgele bestanden aus 4 % (w/v) Acrylamid: N,N´-Methylenbisacrylamid (37, 5:1), 125 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,1 % (w/v) SDS, 0,2 % (v/v) TEMED und 0,1 % (w/v) APS.

Vor dem Auftragen wurden die Proteinextrakte mit SDS-Probenpuffer (2 x SDS-Probenpuffer:

0,2 M Tris, 15 % (v/v) Glycerin, 6 % (w/v) SDS, 10 % (v/v) β-Mercaptoethanol, 0,05 % (w/v) Bromphenolblau) versetzt und durch 5-minütige Inkubation bei 100°C inkubiert. Proteinextrakte, die bereits unter denaturierten Bedingungen präpariert worden waren, wurden vor Beladen des Gels 10 min bei 65°C inkubiert.

Die Elektrophorese erfolgte mit SDS-Laufpuffer (25 mM Tris, 190 mM Glycin, 0,1 % (w/v) SDS) bei 160 V bis die Bromphenolblaubande aus dem Gel herausgelaufen war. Zur Bestimmung der Molekulargewichte wurden auf jedem Gel 5 µl eines Proteinstandards (Prestained SDS-PAGE Standard, Broad Range von BioRad) mit aufgetrennt.

4.7.9 Färbung von Proteinen in SDS-Polyacrylamidgelen

Um Proteinbanden sichtbar zu machen, wurden SDS-Polyacrylamidgele mit dem Farbstoff Coomassie Brilliant Blue G-250 gefärbt.

Das Gel wurde zunächst 30 min in Fixierlösung (25 % (v/v) Isopropanol, 10 % (v/v) Essigsäure) geschwenkt und die Lösung anschließend gegen Coomassie-Färbelösung (10 % (v/v) Essigsäure, 0,006 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue G-250) ausgetauscht. Die Lösung wurde zusammen mit dem Gel auf etwa 50°C in der Mikrowelle erwärmt und unter ständiger Bewegung mindestens 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Entfärbung des Hintergrundes erfolgte mit Coomassie-Entfärbelösung (10 % (v/v) Essigsäure) während mehrstündigen Schwenkens bei wiederholtem Wechsel der Lösung.

4.7.10 Immunoblotting (Western-Blot-Analyse)

Als Immunoblotting bezeichnet man generell immunologische Techniken, bei denen man auf Membranen transferierte, immobilisierte Proteine mit geeigneten Antikörpern reagieren lässt. Beim Western-Blot werden die Proteine zuvor in einer SDS-DISKPAGE aufgetrennt und aus dem Trenngel auf einem geeigneten Trägerfilter, z. B. PVDF oder Nitrocellulose, übertragen. Für die Western-Blot-Analyse wurden 10 µl Hefeproteinextrakte (Kapitel 4.7.1), 10-20 µl denaturierte Gesamtzellextrakte (Kapitel 4.7.2), 5-15 µl denaturierte Kernproteinextrakte (Kapitel 4.7.4.1) und 10 g native Kernproteinextrakte (Kapitel 4.7.4.2) verwendet.

4.7.10.1 Semi-Dry Proteinblot

In dieser Arbeit wurden Proteine aus SDS-Polyacrylamidgelen mit der „Semi-Dry-Blotting“-Methode (modifiziert nach KYSE und ANDERSON, 1984) im elektrischen Feld zwischen zwei Graphitplatten auf PVDF-Membranen übertragen. Die Auswahl der Transferbedingungen orientierte sich an den Angaben von DUNBAR (1994, Kapitel 4 und 5).

Das SDS-Gel wurde nach Abschluss der Elektrophorese 15 min in Kathodenpuffer (25 mM Tris, 40 mM 6-aminohexansäure, 20 % (v/v) Methanol, pH 9,4) und die zugeschnittene PVDF-Membran nach Aktivierung in Methanol in Anodenpuffer II (25 mM Tris, 20 % Methanol, pH 10,4) äquilibriert. In der Elektroblotapparatur folgte auf zwei Lagen Anodenpuffer I (0,3 M Tris, 20 % Methanol, pH 10,4) getränktes Filterpapier eine Lage Anodenpuffer II getränktes Filterpapier. Auf diese Lagen wurde die äquilibrierte PVDF-Membran gelegt, gefolgt vom Gel und drei Lagen in Kathodenpuffer getränktem Filterpapier. Bei Gelen der Dicke 0,8 mm-1 mm erfolgte der Transfer bei einer Stromstärke von 1 mA/cm² über einen Zeitraum von einer Stunde. Die Membran wurde entsprechend der Empfehlung des Herstellers in Methanol gewaschen und anschließend für die Lagerung getrocknet.

4.7.10.2 Immunologische Detektion geblotteter Proteine

Bei der hier angewendeten indirekten Nachweismethode wurden die Membranen nach Absättigung unspezifischer Bindestellen („Blocken“ durch Magermilchpulver) zunächst mit dem spezifischen Primärantikörper aus Kaninchen inkubiert. Gebundene Primärantikörper wurden nachfolgend von einem an Peroxidase gekoppelten anti-Kaninchen-Sekundärantikörper aus Esel (anti rabbit Ig von Amersham) erkannt. Die Detektion erfolgte über Chemilumizenz nach Umsetzung eines entsprechenden Substrates durch gekoppelte Peroxidase. Für diesen Nachweis wurde der ECL⁺-Kit der Firma Amersham den Herstellerangaben entsprechend verwendet. Die Exposition der Röntgenfilme (Cronex 10T) betrug 1 min bis 10 min, abhängig von den jeweiligen Signalstärken.

Alle Inkubationsschritte wurden bei Raumtemperatur unter Schütteln durchgeführt. Die Membran wurde zuvor in Methanol aktiviert und in 1 x PBS-T (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 4,0 mM Na2HPO4, pH 7,4 mit 0,05 % (v/v) Tween-20) äquilibriert.

Blocken: 1 h in 1 x PBS-T mit 5 % (w/v) Magermilchpulver Waschen: 2 x 5 min in 1 x PBS-T mit 1 % (w/v) Magermilchpulver

Primärantikörper: 2 h in 1 x PBS-T mit 1 % (w/v) Magermilchpulver, αTGA2.1/αTGA2.x (1:1000)

Waschen: 2 x 5 min in 1 x PBS-T mit 1 % (w/v) Magermilchpulver 2 x 5 min in 1 x PBS-T

Sekundärantikörper: 1 h in 1 x PBS-T, anti rabbit Ig (1:25.000) Waschen: 5 x 5 min in 1 x PBS-T

4.7.10.3 Rehybridisierung

Um eine Membran, mit der bereits eine Western-Blot-Analyse durchgeführt worden ist, mit einem weiteren Primärantikörper zu inkubieren, müssen die gebundenen Antikörper zunächst entfernt werden („Strippen“). Dazu wurde die Membran mit Methanol aktiviert und in 1 x PBS-T (70 mM NaCl, 1,35 mM KCl, 0,75 mM KH2PO4, 4,05 Na2HPO4, pH 7,4 mit 0,05 % (v/v) Tween-20) äquilibriert.

Anschließend wurde die Membran 3 x in 0,1 M Glycin pH 2,5 inkubiert. Die gestrippte Membran konnte nun erneut hybridisiert werden.