Ribonuclease Protection Assay (RPA)

2.4.1. Generierung der radioaktiv markierten RNA-Sonden

Die in-vitro-Transkription der Sonden, die eine doppelsträngige DNA-Vorlage in RNA umschreibt und dabei radioaktiv-markierte Nukleotide einbaut, wurde mit Hilfe des MAXIscript Kits von Ambion durchgeführt. Als template für die zunächst per PCR zu synthetisierende DNA-Vorlage, diente ein pcDNA3 Vektor (laborinterne Nr. 432), der den humanen icp75TNFR in voller Länge enthielt. Dabei war der 5’ Primer für beide

Sonden identisch, über den 3’ Primer wurde sowohl ihre Länge festgelegt, als auch der Promotor für die T7 Phagen-RNA-Polymerase an die DNA-Matrize angehängt.

Die PCR zur Gewinnung der DNA-Vorlage für die späteren Sonden wurde nach folgendem PCR-Protokoll durchgeführt:

Plasmid 1 µl

10x Puffer 5 µl 2 min. 94° C

5’ Primer (10 pM/ml) 5 µl 30 Sek. 94° C

3’ Primer (10 pM/ml) 5 µl 30 Sek. 62° C 35x

dNTPs (10 mM) 1 µl 1 min. 68° C

Taq-Polymerase 1,25 µl 20 min. 68° C → 4° C ∞

Wasser ad 50 µl

Die PCR-Produkte wurden über ein Polyacrylamid-Gel (8 % w/v PAA) aufgetrennt, die entsprechenden Banden ausgeschnitten, die DNA durch passive Diffusion aus dem Gel in Elutionspuffer (Bestandteil des RPA III Kits) überführt und durch Zugabe von 3 Volumeneinheiten 100 % Ethanol gefällt. Nach einem Waschschritt mit Ethanol 70 % wurde die DNA in 50 µl Nuklease freiem Wasser aufgenommen.

Die so gewonnenen Matrizen für die beiden hicp75TNFR-spezifischen Sonden konnten dann in die eigentliche in-vitro-Transkription eingesetzt werden. Als Positivkontrolle für den RPA wurde auch für das housekeeping-Gen β-Actin eine Sonde generiert. Die passende DNA-Matrize ist in Form eines Plasmides (pTRI-Actin-Mouse), welches ebenfalls den T7 RNA-Polymerase Promotor enthält, im MAXIscript Kit enthalten und kann direkt in die in-vitro-Transkription eingesetzt werden.

In-vitro-Transkription:

DNA-Matrize / pTRI-Actin-Mouse 2 µl / 1 µl

10x Transkriptions-Puffer 2 µl

10 mM ATP/CTP/GTP 3 µl

[α³²P] UTP (20 mCi/ml) 5 µl

T7-RNA-Polymerase 2 µl

Nuklease freies Wasser ad 20 µl → 1 h bei 37° C

2.4.2. Reinigung der radioaktiven Sonden

Um zu garantieren, dass die Sonden im RPA in voller Länge eingesetzt werden, müssen sie über ein denaturierendes Polyacrylamid-Gel gereinigt werden. Dazu wurde ein Gel mit einem PAA-Anteil von 10 % (w/v) und einem Harnstoff-Gehalt von 50 % (w/v) hergestellt:

Sequenziergel Konzentrat (25 % PAA) 18 ml Sequenziergel Verdünnungs-Lsg. 27 ml Sequenziergel Puffer-Konzentrat (10x) 4,5 ml

APS 360 µl

TEMED 54 µl

Die elektrophoretische Auftrennung in 1x TBE-Puffer wurde gestoppt, als das Bromphenolblau des Laufpuffers das Ende des Gels erreicht hatte. Eine der beiden Glasplatten wurde entfernt und das Gel mit der verbleibenden Glasplatte in Frischhaltefolie verpackt. Durch Auflegen eines Röntgenfilmes auf die nur mit Folie bedeckte Seite des Gels für 1-2 Minuten und Entwicklung des Films, wurden die Sonden sichtbar gemacht und konnten aus dem Gel mit einem Skalpell ausgeschnitten werden. Da die Wiedergewinnung von Nukleinsäuren aus Polyacrylamid-Gelen effektiver wird, je größer die Oberfläche des Gelstückes ist, wurden die ausgeschnittenen Fragmente zunächst durch die Kanüle einer 10 ml Spritze gepresst, bevor sie über Nacht in 350 µl Elutionspuffer (im Kit enthalten) auf einem Thermomixer bei RT inkubiert wurden.

Durch Zugabe von 1050 µl Ethanol 100 % konnten die Sonden ausgefällt und aufkonzentriert werden. Das Endvolumen nach einem zusätzlichen Waschschritt mit Ethanol 70 % betrug 50 µl (in Nuklease freiem Wasser).

2.4.3. Hybridisierung von RNA und Sonde

Von den aufgereinigten Sonden wurden je 5 µl mit mRNA aus stimulierten THP-1 Zellen gemischt. Die RNA wurde zunächst als Gesamt-RNA isoliert und anschließend daraus über den Oligotex Kit mRNA gereinigt. Je Hybridisierung wurde auf diese Weise mRNA entprechend 50 µg Gesamt-RNA eingesetzt. Für jede Sonde wurden zusätzlich zwei minus-mRNA Kontrollen angesetzt, denen anstelle der RNA aus THP-1 Zellen RNA aus Hefe in gleicher Konzentration zugesetzt wurde. Eine der beiden Kontrollen erhielt wie

mehr zu detektieren sein, die einzelsträngige Sonde sollte komplett durch die Enzyme verdaut werden. Der zweiten minus-mRNA Kontrolle wurde kein Enzym zugefügt. Im Gel bildet diese Probe die Länge der reinen Sonde ab.

Vor der eigentlichen Hybridisierung wurde die mRNA mit der jeweiligen Sonde zunächst copräzipitiert. Zu diesem Zweck wurden die Proben auf eine Konzentration von 0,5 M Ammoniumacetat eingestellt und mit 2,5 Volumeneinheiten Ethanol 100 % versetzt. Die Präzipitation erfolgte bei –20° C für 15 Minuten und anschließende Zentrifugation für 15 Minuten bei 4° C auf höchster Geschwindigkeit (16 000 g). Die luftgetrockneten Pellets wurden in 10 µl Hybridisierungspuffer aufgenommen, bei 95° C für 4 Minuten de-naturiert und über Nacht bei 42° C inkubiert. In dieser Zeit sollten die Sonden an die jeweils komplementäre mRNA binden und dadurch doppelsträngige Sequenzbereiche entstehen.

2.4.4. Verdau und Aufarbeitung der Proben

Zu jeder der hybridisierten Proben, außer zu jeweils einer der beiden minus-mRNA Kontrollen, wurden 150 µl einer 1:100 Verdünnung von Digestion III Puffer und einer Mischung aus RNase A und RNase T1 gegeben, um einzelsträngige RNA abzubauen. Die minus-mRNA Kontrollen, die nicht mit Enzym versetzt wurden, erhielten statt dessen reinen Digestion III Puffer. Der RNase-Verdau wurde bei 37° C für 30 Minuten durchgeführt. Durch Zugabe von 225 µl RNase Inactivation/Precipitation III Lösung und 75 µl Ethanol 100 % wurde die Reaktion abgestoppt und die verbleibenden RNA-Fragmente durch eine Inkubation von 15 Minuten bei –20° C präzipitiert. Nach 15-minütiger Zentrifugation auf voller Geschwindigkeit (16 000 g) wurde der Überstand abgenommen und die Pellets in 10 µl Gel Loading Puffer II resuspendiert. Bevor die Proben vollständig auf ein denaturierendes PAA-Gel aufgetragen werden konnten, wurden sie für 3 Minuten bei 95° C denaturiert. Von der minus-mRNA Kontrolle ohne RNase-Verdau wurde nur 1 µl, aufgefüllt auf 10 µl mit Gel Loading Puffer II, für das Gel verwendet, da diese Probe die reine Sonde enthält und die Gefahr besteht, dass bei zu großer Menge im Gel die anderen Banden überstrahlt werden.

2.4.5. Auftrennung der Proben über ein Polyacrylamid-Gel

Für das Analysen-Gel wurde wieder ein PAA-Gehalt von 10 % gewählt. Das Gel wurde nach dem Protokoll von Kapitel B 2.4.2. zubereitet. Unmittelbar vor Auftragung der

elektrophoretische Auftrennung wurde gestoppt, als das Bromphenolblau des Laufpuffers das Ende des Gels erreicht hatte. Nachdem wieder eine der beiden Glasplatten entfernt und das Gel zusammen mit der zweiten Glasplatte in Frischhaltefolie verpackt worden war, wurde ein Röntgenfilm aufgelegt und die Filmkassette für eine Stunde bei –80° C gelagert. Nach Entwicklung des Films konnten die einzelnen Banden analysiert werden.