1.4 Relevanz der MAPK- und DNMT-abhängigen Regulation für die Immunerkennung
1.4.1 Relevanz der HLA-Klasse-I-Modulation für die ZTL-Erkennung
MDM2-Protein und damit zu einem geringeren Abbau von p53 führen kann (Ries, Biederer et al. 2000). Da es sich um die nicht-mutierte p-53-Form handelt, kann eine Anreicherung in der Zelle Auswirkungen auf die Apoptose-Induktion haben. Der länger anhaltende stabilisierende Effekt von Sorafenib auf das p53-Protein in HCT116DKO-Zellen ist eine mögliche Erklärung für die höhere Sensitivität dieser Zellen für Apoptose durch die Behandlung. Der Mechanismus des daraufhin erfolgenden Abbaus wird in weiterführenden Arbeiten untersucht. Im Gegensatz zur Veränderung des p53-Gehalts wird die Phosphorylierung an Ser46 durch keinen der beiden Inhibitoren beeinflusst. Das schließt jedoch nicht aus, dass andere Phosphorylierungsstellen, wie das Ser15 an der Regulation beteiligt sind, was ebenfalls Gegenstand weiterer Untersuchungen ist.
1.4 Relevanz der MAPK- und DNMT-abhängigen Regulation für die
0 50 100 150 200 250
o.Zusatz DMSO U0126 o.Zusatz DMSO U0126 o.Zusatz DMSO U0126 o.Zusatz DMSO U0126
HCT116wt HCT116/3b-/- HCT116/1-/- HCT116DKO
Fluoreszenzintensität(MFI)
HLA-A2-Oberflächenexpression A
25
0 5 10 15 20 30
o.Zusatz DMSO U0126 o.Zusatz DMSO U0126 o.Zusatz DMSO U0126 o.Zusatz DMSO U0126
HCT116wt HCT116/3b-/- HCT116/1-/- HCT116DKO
% spezifischeLyse
allo-A2-spezifischer ZTL-Klon B
35
0 50 100 150 200 250
o.Zusatz DMSO U0126 o.Zusatz DMSO U0126 o.Zusatz DMSO U0126 o.Zusatz DMSO U0126
HCT116wt HCT116/3b-/- HCT116/1-/- HCT116DKO
Fluoreszenzintensität(MFI)
HLA-A2-Oberflächenexpression A
25
0 5 10 15 20 30
o.Zusatz DMSO U0126 o.Zusatz DMSO U0126 o.Zusatz DMSO U0126 o.Zusatz DMSO U0126
HCT116wt HCT116/3b-/- HCT116/1-/- HCT116DKO
% spezifischeLyse
allo-A2-spezifischer ZTL-Klon B
35
Abb. 35 Untersuchung der HLA-A2-Expression auf 96 h behandelten HCT116-Zell-Varianten und der Lyse durch den ZTL-Klon JB4.
A HLA-A2-Oberflächenexpression der HCT116-Zellvarianten. B % Spezifische Lyse der Zielzellen im Chromfreisetzungstest durch den allo-A2-spezifischen ZTL-Klon JB4. Weiß: HCT116-Zellvarianten ohne Zusatz kultiviert, grau: DMSO-Kontrolle (0,1
%), schwarz: U0126-Behandlung (10 µM). Dargestellt ist eines von mehr als 3 unabhängigen Experimenten.
Wie in Abb. 35 nochmals bestätigt wurde, führt die MEK-Inhibition bzw. der DNMT-Defekt zu einer erhöhten HLA-A2-Expression und spiegelt sich in der spezifischen Lyse der Zellen durch den JB4-ZTL-Klon wider. Dabei werden unbehandelte HCT116DKO-Zellen bereits besser lysiert als HCT116wt-Zellen, was durch Behandlung mit U0126 noch weiter gesteigert werden kann. Eine ähnlich gute Steigerung der Lyse kann bereits bei der DNMT1-Deletions-Variante beobachtet werden, wobei auch hier die MEK-Inhibition durch U0126 die Zelllyse noch verbessert. Damit korreliert die Lyse durch den allo-A2-spezifischen ZTL-Klon gut mit der HLA-A2-Expression auf den Zielzellen. Auffällig ist dagegen die schlechtere Lyse der HCT116/3b-/--Variante, welche unabhängig von der MEK-Inhibitor-Behandlung, trotz der höheren HLA-A2-Expression im Vergleich zu HCT116wt-Zellen, stattfindet. Da es sich bei der HCT116/3b-/--Variante um eine ICAM-1-negative Zelllinie handelt (Abb. 16), liegt diese schlechtere Erkennung durch den T-Zellklon wahrscheinlich an der deutlich schwächeren Ausbildung der immunologischen Synapse, die durch die fehlenden ICAM-1/LFA-1-Adhäsion verursacht wird. Diese Bedeutung der ICAM-1/LFA-1-Interaktion sowohl für die ZTL- als auch für die NK-Zell-Erkennung wurde bereits in mehreren Publikationen gezeigt (Sirim, Zeitlmann et al. 2001, Bryceson, March et al. 2006). Da in diesen klassischen Zytotoxizitätsversuchen die Lyse der Zielzelle anhand der Chromfreisetzung gemessen wird, kann mit diesem Verfahren zwischen der Sensitivität der Zielzelle und der Aktivierung der zytotoxischen Effektorzelle nicht unterschieden werden. Durch die Bestimmung der CD107a-Moleküle auf der Killerzelle, die als Membranmoleküle der zytotoxischen Granula bei
Degranulation der Effektorzelle durch Zielzell-Kontakt transient auf der Oberfläche erscheinen, ist es aber möglich die Aktivierung der Killerzellen parallel mit dem Phänotyp durchflusszytometrisch zu quantifizieren (siehe Methoden 3.2). Mit diesem experimentellen Aufbau ist die Frage zu beantworten, ob die erhöhte Lyse der U0126-behandelten Zielzellen bzw. der DNMT-Deletions-Varianten tatsächlich an der, aufgrund der erhöhten HLA-A2-Expression, gesteigerten Aktivierung des ZTL-Klons liegt, oder, ob im Chromfreisetzungstest die Zielzellen lediglich sensitiver auf die lytischen Signale reagieren. Dies bietet den großen Vorteil, dass nicht andere Effekte, wie Apoptose-Resistenzmechanismen bzw. höhere Apoptose-Sensitivität der Zielzellen, das Ergebnis der Immunerkennung beeinflussen. Dazu wurden die Zielzellen, wie bei den Chromfreisetzungstests, 96 h mit U0126 bzw. DMSO behandelt und dann mit dem ZTL-Klon 4 h koinkubiert. Als Aktivitäts-Kontrolle wird in allen Versuchen auch die spontane Degranulation durch Inkubation der Effektorzellen ohne Zielzellen untersucht (Abb. 36).
101 102 103 104
unbehandelt
DMSO
U0126
FL2-H
HCT116wt 3b -/- 1 -/- DKO
Ohne Zielzelle
CD3
CD107a
101 102 103 104 101 102 103 104
100 101 102 103 104 101102103104101102103104101102103104101102103104
17,9 %
15,7 % 5,9 % 36,7 % 52,4 %
6,2 % 39,9 % 53,3 %
16,8 % 49,3 %
28,8 %
2,4 %
27,0 %
101 102 103 104 101 102 103 104
unbehandelt
DMSO
U0126
FL2-H
HCT116wt 3b -/- 1 -/- DKO
Ohne Zielzelle
CD3
CD107a
101 102 103 104 101 102 103 104 101 102 103 104
101 102 103 104
100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 101102103104101102103104101102103104101102103104101102103104101102103104101102103104101102103104
17,9 %
15,7 % 5,9 % 36,7 % 52,4 %
6,2 % 39,9 % 53,3 %
16,8 % 49,3 %
28,8 %
2,4 %
27,0 %
Abb. 36 Transiente CD107a-Expression auf dem ZTL-Klon (JB4) nach Aktivierung durch verschieden behandelte Zielzellen.
Von links nach rechts ist der ZTL-Klon nach Inkubation mit den verschiedenen HCT116-Zellvarianten aufgetragen, die 96 h lang mit Medium (oberste Reihe), mit dem Lösungsmittel DMSO (0,1%) oder mit dem MEK-Inhibitor U0126 (10 µM) behandelt wurden. Unten ist die spontane Degranulation von JB4-T-Zellen gezeigt. Der prozentuale Anteil der CD107a+-ZTL-Zellen ist angegeben. Dargestellt ist eines von mehr als 3 repräsentativen Experimenten.
Auch die Degranulation, als Maß der Zielzellerkennung durch den ZTL-Klon, zeigt eine deutliche Steigerung nach Kontakt mit unbehandelten HCT116DKO-Zellen (52,4 %) im Vergleich zu HCT116wt-Zellen (15,7 %, oberste Zeile). Ebenso führt eine Inhibition des MEK/ERK-Signalweges durch U0126 in den Wildtyp-Zellen zu einer gesteigerten Degranulation des T-Zell-Klons (28,8 %). Die ICAM-1-negative HCT116/3b-/--Zelllinie wird nicht nur, wie bereits im Chromfreisetzungstest gezeigt, schlechter lysiert, sondern führt offensichtlich auch zu einer schlechteren Aktivierung des ZTL-Klons, so dass ein Apoptose-Resistenzmechanismus für diese Beobachtung ausgeschlossen werden kann.
Um weiterhin experimentell auszuschließen, dass diese bessere Erkennung nach Inhibitor-Behandlung zellspezifisch erfolgt, aufgrund anderer Oberflächenveränderungen, wurden zwei weitere HLA-A2-positive Kolon-Karzinom-Zelllinien, SW480 und SW948, als Zielzellen für den ZTL-Klon JB4 in Degranulationsversuchen eingesetzt. Hierbei wurde zusätzlich eine Behandlung der Zielzellen mit Sorafenib durchgeführt, was bei den beiden Zelllinien möglich war, da sie, wie bereits in Abb. 19 gezeigt, in Bezug auf das Überleben weniger sensitiv auf eine U0126- bzw. Sorafenib-Behandlung reagieren, aber dennoch eine gesteigerte HLA-A2-Expression zeigen (Abb. 37/A).
0 50 100 150 200 250 300
DMSO U0126 Sorafenib DMSO U0126 Sorafenib
SW480 SW948
Fluoreszenzintensität(MFI)
HLA-A2-Oberflächenexpression A
0 10 20 30 40 50
DMSO U0126 Sorafenib DMSO U0126 Sorafenib
SW480 SW948
ohne Zielzelle
% CD107a-positive ZTL
allo-A2-spezifischer ZTL-Klon B
0 50 100 150 200 250 300
DMSO U0126 Sorafenib DMSO U0126 Sorafenib
SW480 SW948
Fluoreszenzintensität(MFI)
HLA-A2-Oberflächenexpression A
0 10 20 30 40 50
DMSO U0126 Sorafenib DMSO U0126 Sorafenib
SW480 SW948
ohne Zielzelle
% CD107a-positive ZTL
allo-A2-spezifischer ZTL-Klon B
Abb. 37 Quantifizierung der HLA-A2-Expression auf SW480 und SW948-Zellen und der Degranulation des Klons.
A HLA-A2-Expression auf den Zielzellen SW480 und SW948 nach 96 h Behandlung mit den Inhibitoren B % CD107a-positive JB4-T-Zellen nach Aktivierung durch die unterschiedlich behandelten Zielzellen. DMSO (0,2 %, weiß), U0126 (20 µM, grau) und Sorafenib (10 µM, schwarz). Der Ansatz ohne Zielzelle zeigt die spontane Degranulation des ZTL-Klons.
Auch in den beiden Kolon-Karzinom-Zelllinien SW480 und SW948 führt eine gesteigerte HLA-A2-Expression, als Folge der MEK/ERK-Inhibition, zu einer besseren Erkennung durch den ZTL-Klon JB4. Dabei spiegelt die geringere Degranulation von JB4 nach Aktivierung durch SW948 im Vergleich zu SW480-Zellen nicht nur die quantitativen Unterschiede im
HLA-A2-Expressionsniveau wider. Zusätzlich zeichnet sich SW948 auch durch eine geringe ICAM-1-Expression aus (Daten im Anhang, Abb. 60), was ebenfalls zu der schwächeren Degranulation beiträgt. Obwohl die Sorafenib-Behandlung der SW948-Zellen zu einer geringeren Erhöhung der HLA-A2-Expression im Vergleich zu U0126 führt, erreicht die Degranulation des ZTL-Klons gegen Sorafenib-behandelte Zellen das gleiche Niveau. Die durchflusszytometrische Analyse der Zielzellen zeigte, dass die ICAM-1-Expression durch Sorafenib leicht gesteigert wurde (Daten nicht gezeigt), was eine Erklärung für die bessere Aktivierung bietet.
1.4.2 Relevanz der ULBP2- und HLA-Klasse-I-Modulation für die