1.3 Auswirkungen der B-Raf- bzw. MEK-Blockierung auf die nachfolgenden Signalwege76
1.3.2 Kinetik der B-Raf- bzw. MEK-Inhibition
Um die Auswirkung der beiden Inhibitoren U0126 und Sorafenib auf den MEK/ERK-Signalweg (Abb. 29) zu untersuchen, wurde eine vergleichende Kinetik in HCT116wt- und DKO-Zellen durchgeführt (Abb. 30 und Abb. 31).
Abb. 29 Schematische Darstellung des MEK/ERK-Signalweges und der Blockierungsstellen durch den MEK-Inhibitor U0126 und den B-Raf-Inhibitor Sorafenib.
Dargestellt sind die Komponenten des MEK/ERK-Signalweges, deren Proteinmenge und Phosphorylierungsgrad im Folgenden in den Proteinlysaten der Kolon-Karzinom-Zelllinien HCT116wt und der DKO-Variante im Multiplex-Verfahren mit und ohne Einsatz der beiden Inhibitoren untersucht wurden. Daneben besitzen ERK1/2-Kinasen und auch die Kinase p90RSK zahlreiche andere Zielmoleküle, meist Transkriptionsfaktoren (TFs), was durch die gestrichelten Pfeile ausgedrückt werden soll.
HCT116wt- und DKO-Zellen wurden maximal 96 h mit den Inhibitoren U0126 bzw.
Sorafenib und DMSO behandelt, und zu verschiedenen Zeitpunkten Lysate hergestellt (Abb.
30 und Abb. 31). Nach Einstellung der Proteinkonzentration wurden die Lysate bezüglich der Veränderungen im Total-Kinase-Gehalt bzw. der Phosphorylierung von MEK1 und ERK1/2, und der im MAPK-Weg nachgeschalteten Kinase p90RSK, sowie Histon-H3 im Multiplex-Verfahren analysiert. Der Vorteil der Multiplex-Methode zur Bestimmung von Phospho-Proteinen ist die gleichzeitige Semiquantifizierung der Total-Protein-Menge und dem phosphorylierten Anteil verschiedener Kinasen aus einem Lysat, was einen direkten Vergleich der unterschiedlichen Komponenten erlaubt.
.
ERK1 B-Raf
p90RSK
MEK1 P
MEK2
ERK2
TFs P
P
P P
K-RAS
GTP
P P
P
Sorafenib
U0126
Histon-H3 P
ERK1 B-Raf
p90RSK
MEK1 P P
MEK2
ERK2
TFs P P P P
P P
P P
K-RAS K-RASGTP
K-RAS
GTP GTP
P P P P
P P
Sorafenib
U0126
Histon-H3 P Histon-H3
P P
p-MEK1Ser217/Ser221
0 4000 8000 12000
MFI
t-ERK1/2
0 1000 2000 3000 4000
p-ERK1/2Thr202/Tyr204; Thr185/Tyr187
0 2000 6000 10000 14000
MFI
t-p90RSK
0 100 300 500 700 900
0' 15' 30' 3h 6h 24h 48h 72h 96h
p-p90RSK Thr359/Ser361
0 100 200 300 400 500
MFI
p-Histon-H3Ser10
0 100 300 500 700 900
0' 15' 30' 3h 6h 24h 48h 72h 96h
MFI DMSOU0126
Sorafenib
t-MEK1
0 4000 8000 12000 16000
HCT116wt
p-MEK1Ser217/Ser221
0 4000 8000 12000
MFI
t-ERK1/2
0 1000 2000 3000 4000
p-ERK1/2Thr202/Tyr204; Thr185/Tyr187
0 2000 6000 10000 14000
MFI
t-p90RSK
0 100 300 500 700 900
0' 15' 30' 3h 6h 24h 48h 72h 96h
p-p90RSK Thr359/Ser361
0 100 200 300 400 500
MFI
p-Histon-H3Ser10
0 100 300 500 700 900
0' 15' 30' 3h 6h 24h 48h 72h 96h
MFI DMSOU0126
Sorafenib
t-MEK1
0 4000 8000 12000 16000
p-MEK1Ser217/Ser221
0 4000 8000 12000
MFI
t-ERK1/2
0 1000 2000 3000 4000
p-ERK1/2Thr202/Tyr204; Thr185/Tyr187
0 2000 6000 10000 14000
MFI
t-p90RSK
0 100 300 500 700 900
0' 15' 30' 3h 6h 24h 48h 72h 96h
p-p90RSK Thr359/Ser361
0 100 200 300 400 500
MFI
p-Histon-H3Ser10
0 100 300 500 700 900
0' 15' 30' 3h 6h 24h 48h 72h 96h
MFI DMSOU0126
Sorafenib DMSO U0126 Sorafenib
t-MEK1
0 4000 8000 12000 16000
HCT116wt
Abb. 30 Kinetik der Signalproteine des MEK/ERK-Signalweges nach 96 h Inhibitor-Behandlung der HCT116wt- Zelllinie.
Links sind die phosphorylierten Kinasen dargestellt, rechts als Pendant die Total-Kinase-Mengen, wobei die Semiquantifizierung als Mittlere-Fluoreszenz-Intensität (MFI) angegeben wird. Die Zellen wurden mit U0126 (rot, 20 µM), Sorafenib (blau, 5 µM) und DMSO als Kontrolle behandelt und zu den verschiedenen Zeitpunkten wurden die Lysate hergestellt. Die Lysate wurden auf eine Konzentration von 350 µg/ml eingestellt. Nach 48 h erfolgte ein Mediumwechsel, da die Inhibitoren bei 37°C relativ instabil sind. Die analysierten Phosphorylierungsstellen sind angegeben.
p-MEK1Ser217/Ser221
0 5000 10000 15000 20000
MFI
p-ERK1/2Thr202/Tyr204; Thr185/Tyr187
0 4000 8000 12000 16000
MFI
t-ERK1/2
0 1000 2000 3000 4000 5000
p-p90RSK Thr359/Ser361
0 100 200 300 400 500
MFI
t-p90RSK
0 100 300 500 700 900
0' 15' 30' 3h 6h 24h 48h 72h 96h
MFI
0 200 400 600 800
0' 15' 30' 3h 6h 24h 48h 72h 96h
p-Histon-H3Ser10
DMSO U0126 Sorafenib 0
4000 8000 12000 16000
t-MEK1
HCT116DKO
p-MEK1Ser217/Ser221
0 5000 10000 15000 20000
p-MEK1Ser217/Ser221
0 5000 10000 15000 20000
MFI
p-ERK1/2Thr202/Tyr204; Thr185/Tyr187
0 4000 8000 12000 16000
p-ERK1/2Thr202/Tyr204; Thr185/Tyr187
0 4000 8000 12000 16000
MFI
t-ERK1/2
0 1000 2000 3000 4000 5000
t-ERK1/2
0 1000 2000 3000 4000 5000
p-p90RSK Thr359/Ser361
0 100 200 300 400 500
p-p90RSK Thr359/Ser361
0 100 200 300 400 500
MFI
t-p90RSK
0 100 300 500 700 900
0' 15' 30' 3h 6h 24h 48h 72h 96h
t-p90RSK
0 100 300 500 700 900
0' 15' 30' 3h 6h 24h 48h 72h 96h
MFI
0 200 400 600 800
0' 15' 30' 3h 6h 24h 48h 72h 96h
p-Histon-H3Ser10
0 200 400 600 800
0' 15' 30' 3h 6h 24h 48h 72h 96h
p-Histon-H3Ser10
DMSO U0126 Sorafenib DMSO U0126 Sorafenib 0
4000 8000 12000 16000
t-MEK1
0 4000 8000 12000 16000
t-MEK1
HCT116DKO
Abb. 31 Kinetik der Signalproteine des MEK/ERK-Signalweges nach 96 h Inhibitor-Behandlung der HCT116DKO- Zelllinie.
Links sind die phosphorylierten Kinasen dargestellt, rechts als Pendant die Total-Kinase-Mengen, wobei die Semiquantifizierung als Mittlere-Fluoreszenz-Intensität (MFI) angegeben wird. Die Zellen wurden mit U0126 (rot, 20 µM), Sorafenib (blau, 5 µM) und DMSO als Kontrolle behandelt und zu den verschiedenen Zeitpunkten wurden die Lysate hergestellt. Die Lysate wurden auf eine Konzentration von 400 µg/ml eingestellt Nach 48 h erfolgte ein Mediumwechsel, da die Inhibitoren bei 37°C relativ instabil sind. Die analysierten Phosphorylierungsstellen sind angegeben.
Die HCT116wt- und DKO-Zellen zeigen ein vergleichbares Muster bezüglich der Veränderungen im Total- bzw. Phospho-Proteingehalt. Von oben nach unten sind die Analyte nach ihrer Abfolge im MEK/ERK-Signalweg angeordnet (vgl. Abb. 29). Die Behandlung beider Zellvarianten mit dem MEK-Inhibitor U0126 bzw. dem B-Raf-Inhibitor Sorafenib zeigt in den ersten 72 h keinen Einfluss auf den Gesamt-Proteingehalt von MEK1, ERK1/2 und p-90RSK im Vergleich zur DMSO-Kontrolle, wobei für Histon-H3 kein Gesamtprotein-Test erhältlich ist. Nach 96 h ist bei beiden Zellen nach U0126- und Sorafenib-Behandlung ein Absinken der Total-Mengen von MEK1, ERK1/2 und p90RSK im Vergleich zur DMSO-Kontrolle zu beobachten. Dieser Effekt ist nicht sehr stark ausgeprägt und tritt verglichen mit Melanom- bzw. Leberkarzinom-Zelllinien verzögert auf (Daten nicht gezeigt; Dissertation S.
Maßen bzw. C. Quack). Die Phosphorylierung von MEK1 und ERK1/2 wird durch beide Substanzen unterschiedlich beeinflusst, wobei unter Sorafenib-Behandlung (blaue Rauten) p-MEK1 und p-ERK1/2 mit identischer Kinetik zunächst kurz ansteigen, bevor sie schrittweise über die Zeit abnehmen und nach 3 h ein Niveau erreicht ist, das dann konstant niedrig bleibt.
Dies ist ein zu erwartender Effekt, da Sorafenib ein Inhibitor der MEK-aktivierenden Kinase B-Raf ist. Anders verhält es sich bei U0126-behandelten Zellen, denn hier kommt es nach 3 h sogar zu einer Anreicherung von p-MEK1 im Vergleich zur DMSO-Kontrolle. Eine mögliche Erklärung für diesen Effekt ist die Tatsache, dass U0126 neben der Bindung an unphosphoryliertes MEK1-Protein auch an bereits aktiviertes MEK1 bindet, und anscheinend zu einer Stabilisierung der MEK1-Proteine beiträgt. Trotz dieser Stabilisierung von p-MEK1 durch U0126 kommt es bereits nach 15’ zu einem drastischen Abfall der ERK1/2-Phosphorylierung, was die Hemmung der MEK1-Kinase durch U0126 anzeigt. Dieser Effekt ist auch in den Sorafenib behandelten Zellen zu sehen, wenn auch erst nach 3 h eine ähnliche Reduktion im p-ERK1/2-Gehalt auftritt. Die Reduktion von p-ERK1/2 tritt also nach beiden Behandlungen auf, basiert aber auf verschiedenen Mechanismen. Die Inhibition des MEK/ERK-Signalweges setzt sich auch in der verminderten Phosphorylierung von p90RSK, einer nachgeschalteten ERK-regulierten Kinase, fort. p90RSK phosphoryliert u.a. auch Histon-H3 am N-Terminus, wobei in diesem Fall die Phosphorylierung an Serin 10 untersucht wurde.
Die Inhibition durch U0126 oder Sorafenib scheint sich in der Kaskade jedoch nicht mehr weit genug nach unten durchsetzen zu können, da keine Veränderung der Histon-H3Ser10 -Phosphorylierung im Vergleich zur Kontrolle sichtbar ist. Die auch in der DMSO-Kontrolle beobachteten Schwankungen über die Zeit sind eher mit dem Zellzyklus zu korrelieren. Die Blockierung des MEK/ERK-Signalweges ist also auch in der verminderten Aktivierung verschiedener nachfolgender Kinasen zu verfolgen.
1.3.3 Auswirkung der Inhibitoren auf andere Kinasen und