Reinigung II: Anionenaustauschchromatographie

Aufreini-gungsmethode und war aus aufreinigungsstrategischen Erwägungen nach der Primäraufreini-gung anzusiedeln. In der HIC mussten 0,8 M Ammoniumsulfat und 20 % Isopropanol einge-setzt werden, die als prozessverursachte Verunreinigungen im Final Bulk abgereinigt sein mussten (Chmiel, 2006). Durch die folgenden zwei Chromatographieschritte (AIEX und SEC) konnte eine Abreicherung dieser kritischen Verunreinigungen gewährleistet werden.

Phenyl Sepharose 6 FF war aufgrund der hohen möglichen Flussraten von bis zu 300 cm/h zur Verarbeitung der relativ großen Volumina aus der Primäraufreinigung geeignet. Die Pro-duktbindung konnte und musste bei niedrigen Ammoniumsulfatkonzentrationen von 0,8 M erfolgen, da es sonst zu einem Ausfallen von Produkt und Schwierigkeiten mit der Filtration vor dem Probenauftrag kam. Der Probenauftragspeak enthielt kein rhGH, aber Wirtszellprote-in (Kapitel 3.3.7, Tabelle 20); die Adsorption war also quantitativ.

Die Elution mit 20 % Isopropanol lieferte im Mittel von drei Chromatographien eine Ausbeu-te von 81,7 %. Durch einen 40 % Isopropanol enthalAusbeu-tenden Puffer konnAusbeu-te sie auf einen Durchschnittswert von 90,2 % verbessert werden. Da für den folgenden, bei niedrigen Fluss-raten betriebenen Aufreinigungsschritt die Isopropanolkonzentration auf 10 % verdünnt wer-den musste, wäre dies unpraktikabel. Außerdem gab es Anzeichen, dass durch Zugabe von 40 %igem Isopropanol eine Dimerbildung des rhGH gefördert wird (Daten nicht gezeigt).

Zumindest führt 30 %iges 1-Propanol zu reversiblen Veränderungen in der Tertitärstruktur von rhGH, dem so genannten „molten globule state“ (Wicar et al., 1994). Daher ist nicht aus-zuschließen, dass auch 40 %iges Isopropanol zu strukturellen Veränderungen führen könnte.

Daher wurden die Ausbeuteverluste hingenommen und 20 % Isopropanol verwendet. Vorteil-haft war am Einsatz von Isopropanol neben der verbesserten Produktdesorption, dass es ab einer Konzentration von 10 % als robuster chemischer Schritt zur Virusinaktivierung gilt (Chmiel, 2006).

das Produkt so stark aufkonzentriert werden, dass es für den letzten Chromatographieschritt eingesetzt werden konnte.

Zu diesem Zweck wurde eine Anionenaustauschchromatographie mit 18 mL Q Sepharose™

High Performance eingesetzt. Der Ligand, quaternäres Ammonium, wies als starker Anionen-austauscher über ein großes pH-Intervall positive Nettoladungen auf. Das Gelmaterial wurde in eine XK16-Säule gepackt und die Versuche mit einem FPLC™-System bei einer konstan-ten linearen Flussrate von 149,2 cm/h durchgeführt. Da das Eluat der Hydrophoben Interakti-onschromatographie in Äquilibrierungspuffer der Anionenaustauschchromatographie aufge-nommen wurde, konnten Leitfähigkeiten unter 3 mS/cm ohne eine weitere Verdünnung er-reicht werden. Ein direkter Auftrag des unverdünnten Eluats der HIC mit einer Isopropanol-konzentration von 20 % hatte zu einer nicht quantitativen Bindung geführt (Ausbeute 51,0 %, Wiederfindung 80,7 %). Der pH-Wert wurde zum Probenauftrag auf 6,3 eingestellt, um eine negative Nettoladung des rhGH zu erreichen und gleichzeitig möglichst viel Wirtszellprotein nicht negativ zu laden. Die Äquilibrierung und das Waschen nach dem Probenauftrag erfolgte mit 0,025 M Bis-Tris (pKs 6,46, pH 6,30, Leitfähigkeit 2,1 mS/cm), wobei das Produkt voll-ständig an den Ligand adsorbierte. Die Elution erfolgte durch eine erhöhte Salzkonzentration im Elutionspuffer bei pH 6,30 (0,025 M Bis-Tris, 0,3 M Natriumchlorid, Leitfähigkeit 30,4 mS/cm) quantitativ.

-1 1 3 5 7 9

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Zeit [min]

A280 nm [-]

-5 15 35 55 75 95

Konduktivität [mS/cm]

UV Konduktivität

Äquilibrierung Belad. Wasch. Elution Reinigung

Abbildung 67: Chromatogramm der Reinigung II mit einer Anionenaustauschchromatographie.

Wie das Chromatogramm in Abbildung 67 zeigt, kam es während des Probenauftrags und des Waschens nicht zu einem deutlichen Anstieg der UV-Absorption bei 280 nm. Dies ging mit einer quantitativen Bindung des humanen Wachstumshormons einher. Der Elutionspeak war aufgrund der guten Packung des Gelbetts sehr symmetrisch und das Elutionsvolumen betrug mit durchschnittlich 6,4 mL nur ein Drittel eines Säulenvolumens. In einem der Experimente konnte die Konzentration von 283,8 mg/L in der Ausgangslösung auf 1497,9 mg/L im Eluat erhöht werden. Während der Reinigung mit 1 M Natriumhydroxid/ 20 % Isopropanol war kaum ein Anstieg der UV-Absorption zu erkennen. Die rhGH-Ausbeute betrug im Mittel von drei Chromatographien 98,4 % bei einer Wiederfindung von 99,2 %. Die spezifische Pro-duktbeladung betrug mindestens 0,43 mg rhGH/mL Gelmaterial; es wurde jedoch kein Durch-bruch festgestellt.

3.3.5.1.1 Anionenaustauscher als alternativer Reinigungsschritt I

Vor dem Etablieren der gezeigten Reinigungssequenz wurde anstatt der HIC eine Anione-naustauschchromatographie als Reinigungsschritt I untersucht und das gewonnene Produkt im Tierversuch und Nb2-Zellproliferationstest eingesetzt. Bis auf den Bindungs-pH-Wert und den Puffer (pH 8,00, 0,025 M Tris) entsprach die Methode der später eingesetzten.

1 2 3 4 5 6 7 8

hGH-Dimer hGH-Monomer

Abbildung 68: Proben aus der Primäraufreinigung und einer Anionenaustauschchromatographie. Silber-gefärbtes PhastGel™ (8-25 % Polyacrylamid, nicht-reduzierend). Spur 1: CIEX, pH 4,00, Ausgangslö-sung, Spur 2: CIEX, pH 4,00, Durchlauf/Waschen, Spur 3: CIEX, Eluat 1, Spur 4: AIEX, pH 8,00, Aus-gangslösung, Spur 5: AIEX Durchlauf/Waschen, Spur 6: AIEX Eluat 1, Spur 7: AIEX Eluat 2, Spur 8:

rhGH-Standard.

Die Abbildung 68 zeigt ein SDS-Gel, in dem in den ersten drei Spuren die Ausgangslösung, die Durchlauf- /Waschfraktion und das Eluat der bei pH 4,00 durchgeführten

Fließbettchro-matographie CIEX I aufgetragen sind. Bemerkenswert ist die Tatsache, dass in Spur 2 kaum Proteine zu erkennen sind. In dem in Spur 3 aufgetragenen Eluat entsprach die dominante Bande der 22 kDa-Variante des rhGH, darunter lag die 20 kDa-Variante und etwas darüber ein aufgrund der nicht-reduzierenden Bedingungen des SDS-Gels entstandenes Konformer des rhGH. Noch weiter oberhalb ist das rhGH-Dimer zu erkennen.

Das Eluat aus dem Versuch CIEX I wurde entgegen der späteren Aufreinigungssequenz in einer Anionenaustauschchromatographie weiter prozessiert. In der Spur 4 ist die Ausgangslö-sung dieses Versuchs, das auf pH 8,00 eingestellte Eluat aus dem Versuch CIEX I, aufgetra-gen. Die Durchlauf-/ Waschfraktion in Spur 5 war wiederum nahezu proteinfrei, da bei pH 8,00 auch das Wirtszellprotein gebunden wurde. Die erste Elution erfolgte mit 0,3 M Nat-riumchlorid, wobei das Eluat 1 (Spur 6) im Vergleich zur Ausgangslösung um das Vierfache aufkonzentriert wurde. Im Eluat 1 der AIEX wurde die in Spur 3 nur schwach erkennbare Bande bei 14 kDa ebenfalls aufkonzentriert (vergleiche hierzu Abbildung 63). Sie enthält ein bei pH 4,00 entstehendes rhGH-Fragment. In einer zweiten Elution wurde 1,0 M Natrium-chlorid eingesetzt, um die Elutionskraft zu verstärken. Dies erwies sich aber als nicht notwen-dig, da die Desorption aller gebundenen Proteine schon bei der ersten Elution quantitativ er-folgte.

Diskussion: Reinigung II mit Anionenaustauschchromatographie

Die Anionenaustauschchromatographie wurde als diametrale Methode nach der Katione-naustauschchromatographie und der HIC an dritter Stelle der Aufreinigungssequenz einge-setzt. Dieser Aufreinigungsschritt hatte zwei Ziele: Erstens mussten die Verunreinigungen durch Reste von Ammoniumsulfat und durch Isopropanol aus der HIC entfernt werden. Zwei-tens sollte die Aufreinigungssequenz einen selektiven Schritt zur Dimerabreicherung enthal-ten, da zumindest in den Ernten der Perfusionsprozesses der durchschnittliche Monomeranteil nur bei 95,5 % lag. Zur Abreicherung der Dimere sollte abschließend eine Größe-nausschlusschromatographie eingesetzt werden, bei der nur geringe Volumina aufgetragen werden können.

Erste Versuche hatten gezeigt, dass die Isopropanolkonzentration des Eluats aus der HIC durch Verdünnung mit dem Äquilibrierungspuffer von 20 auf 10 % reduziert werden musste, da sonst die Adsorption des rhGH an den Liganden behindert wurde. Die eingesetzte Q Sepharose™ HP erlaubte danach eine quantitative Adsorption des Produkts. Da das Elutions-volumen nur ein Drittel des SäulenElutions-volumens betrug, konnte eine Aufkonzentrierung des Pro-dukts erreicht werden. Auch die Ausbeuten dieses Schritts betrugen nahezu 100 %. Dass die

UV-Absorption weder beim Probenauftrag, noch bei der abschließenden Reinigung anstieg, war ein Indiz für die hohe Reinheit des Produkts zu diesem Zeitpunkt. Insgesamt gelang mit dem Anionenaustauscher eine Produktkonzentrierung und Abreicherung der Prozess-verursachten Verunreinigungen.

In Kapitel 3.3.5.1.1 wurde die Anionenaustauschchromatographie bei pH 8,00 als erster Rei-nigungsschritt vorgestellt. Aufgrund des nicht-selektiven Bindungs-pH-Werts konnte eine Reinigungswirkung im SDS-PAGE nicht festgestellt werden, sondern lediglich eine starke Produktkonzentrierung. Um weniger Wirtszellprotein negativ zu laden, wurde der pH-Wert in der Folge auf 6,3 eingestellt. Es kann nur vermutet werden, dass dies vorteilhaft war, da in der Folge nur noch Eluate aus der HIC in der AIEX weiterverarbeitet wurden und diese in SDS-Gelen eine zu hohe Reinheit hatten.