9.1 AGO2 UNTERLIEGT EINER REGULATION DURCH MIRNAS
Bei einem Vergleich der plasmidbasierten Expression von AGO1 und AGO2 ist auffällig, dass bei gleichen Plasmidkonzentrationen die Konzentrationserhöhung von AGO1 erheblich stärker ist als von AGO2. Dieses Phänomen ist durch eine posttranskriptionelle Regulation von AGO2 erklärbar, die jedoch nicht AGO1 beeinflusst. Neben dem bereits analysierten fehlregulierten Proteinabbau können prinzipiell eine Vielzahl an Regulationsmechanismen für eine spezifische AGO2 Regulation in Frage kommen.
Abbildung III-21: Nachweis der AGO2 Regulation durch miRNAs. (A) Schematische Skizze über die Versuchsdurchführung, bei der eine AGO1 Immunopräzipitation von pIRES oder pAGO2 transfizierten Mel Ju Zellen mit anschließender RNA Isolation durchgeführt wurde. Quantifiziert wurde die RNA durch einen cDNA Array, bei dem die anschließende Datenanalyse zeigte, dass nach der AGO2 Reexpression signifikant mehr AGO2 mRNA an den AGO1 RISC gebunden wurde im Vergleich zur Kontrolle. (B) AGO2 qRT-PCR nach AGO1 und AGO2 Co-Immunopräzipitation im Vergleich zu einer Co-immunopräzipitations-Kontrolle (ctrl.-IP) für einen AGO2 Abbaunachweis durch einen AGO1 oder AGO2 basierten RISC.
Einen möglichen Hinweis auf AGO2 Regulation durch miRNAs zeigte ein Versuch, bei dem AGO2 in der Melanomzelllinie Mel Ju reexprimiert wurde und nach einer AGO1 Immunopräzipitation die an den RISC gebundene RNA durch eine cDNA Array Analyse quantifiziert wurde. Dabei war nach der AGO2 Reexpression ein deutlicher Anstieg der an den AGO1 basierten RISC gebundenen AGO2 mRNA zu messen (Abbildung III-21 A). Die Genexpressionstranskripte der übrigen Argonaut Proteine (AGO1, AGO3 und AGO4) konnten hingegen nicht nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis demonstriert die posttranskriptionale Hemmung von AGO2 durch miRNAs. Zur Verifikation der AGO2 Regulation durch miRNAs wurden aus Mel Ju und Mel Im Proteinlysaten (RIPAs) eine Kontroll- (ctrl.-IP), AGO1- (AGO1-IP) und AGO2- (AGO2-IP) Co-Immunoprezipitationen durchgeführt und die gebundenen mRNAs analysiert. Dabei konnte festgestellt werden, dass das AGO2 Gentranskript in Mel Ju Zellen zu 16 % assoziiert am AGO1 basierten RISC und zu 44 %
Durch das online verfügbare Computer-Programm miRWALK der Universität Heidelberg (http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/index.html) wurden miRNAs, die zu einer potentiellen Bindung an das AGO2 Gentranskript befähigt sind vorhergesagt. Dabei wurden nur miRNAs berücksichtigt, die eine Bindung in der kodierenden Region der AGO2 mRNA aufweisen, und nicht in der 3´oder 5´UTR. Die Fokussierung der Suche nach der AGO2 regulierenden miRNA auf den kodierenden Bereich der AGO2 mRNA ist begründet durch die reprimierte Expression von rekombinanten AGO2 in Melanomzellen. Das Expressionsplasmid, welches für die AGO2 Reexpression in Melanomzellen verwendet wurde, enthält ausschließlich die kodierende Sequenz von AGO2. Somit kann die 3´ und 5´ UTR der AGO2 mRNA als Binderegion für die AGO2 reprimierende miRNA im Melanom ausgeschlossen werden.
Zur Überprüfung des Einflusses einer vorhergesagten miRNA auf AGO2 wurde die jeweilige miRNA Bindestelle in dem pAGO2 Expressionskonstrukt durch zwei stumme Punkt-Mutationen so verändert, dass die jeweiligen miRNAs nicht mehr binden können. Anschließend wurde eine AGO2 Reexpression durch die pAGO2-Mutationsplasmide in der Melanomzelllinie Mel Ju durchgeführt und die Menge an exprimiertem AGO2 durch eine Western Blot Analyse mit zugehöriger Quantifikation nach 24 Stunden bestimmt (Abbildung III-22).
Abbildung III-22: Suche nach möglichen AGO2 regulierenden miRNAs. (A) AGO2 Western Blot Analyse mit zugehöriger (B) AGO2 Western Blot Quantifikation der endogenen und exogenen AGO2 Proteinexpression.
Analysiert wurde die Expressionsstärke der verschiedenen AGO2-Mutationsplasmide (pMut) zur Identifikation von AGO2 regulierenden miRNAs im Melanom. Bestimmt wurde der Status der AGO2 Expression in unbehandelten (kontr.), sowie mit pIRES oder pAGO2 transfizierten Mel Juso Zellen als Referenz für die AGO2 Expression. Die Mengen an AGO2 der AGO2-Mutationsplasmid transfizierten Mel Juso Zellen wurde ebenfalls bestimmt und zeigen eine leicht erhöhte AGO2 Expression bei den pMut-612 transfizierten Zellen.
Im Vergleich zu den unbehandelten (kontr.) und den mit dem Leerplasmid (2 µg pIRES) transfizierten Mel Juso Zellen, ist die AGO2 Proteinexpression in den Zellen die mit 2 µg pAGO2 transfiziert wurden deutlich erhöht. Dies ist an der Zunahme der kleineren der beiden AGO2 Banden erkennbar, da das von dem Expressionskonstrukt translatierte AGO2 eine N-terminale Flag- und NH-Modifikation aufweist. Trotzdem wurde die Gesamtmenge, bestehend aus exogener und endogener AGO2 Proteinexpression, an AGO2 durch die AGO2 Western Blot Quantifikation bestimmt. Es zeigt sich, dass fast alle mit 2 µg Mutationsplasmid transfizierten Mel Juso Zellen einen AGO2 Status aufweisen, der dem AGO2 Status der mit 2 µg pAGO2 transfizierten Zellen entspricht. Die AGO2 Proteinexpression der Zellen, die mit den Mutationsplasmiden pMut-22*, pMut-452 und pMut-346 transfiziert wurden, erreichen nicht das Expressionsniveau wie die Zellen, die mit pAGO2 transfiziert wurden. Dies könnte durch eine Mutation im Expressionsplasmid verursacht worden sein. Es wurden zwar alle gerichteten Mutagenesen
mittels einer Sequenzierung überprüft, jedoch erfolgte keine vollständige Sequenzierung der Plasmide. Das AGO Mutationsplasmid der miRNA-612 (pMut-612) führt hingegen zu einer gesteigerten AGO2 Expression. Dies lässt eine AGO2 Regulation durch die miRNA-612 vermuten, die im Folgenden näher charakterisiert werden soll.
Für den Nachweis der AGO2 Regulation durch miRNA--612 wurden Melanomzellen mit einem miR-612-Inhibitor behandelt, um die negative Regulation der miRNA zu unterbinden und die Interaktion durch einen AGO2 Anstieg nachzuweisen. Die Versuchsergebnisse sind in Abbildung III-23 A dargestellt.
Abbildung III-23: Nachweis der AGO2 Regulation durch miRNA--612. (A) AGO2 und (C) Flag-Western Blot Analysen mit jeweils zugehörigen Quantifikationen (B und D) zur Bestimmung der AGO2 Expression nach miRNA-612-Inhibitor Behandlung im Melanom. Der AGO2 Status steigt bei miRNA-612-miRNA-612-Inhibitor behandelten im Vergleich zu kontrollbehandelten (ctrl. Inhibitor) Mel Juso Zellen nur geringfügig an. Es ist keine AGO2 Expressionssteigerung nach 2 µg pAGO2 oder 2 µg pMut-612 Transfektion und nach miRNA-612-Inhibitor Behandlung im Vergleich zu kontrollbehandelten Zellen detektierbar. Auch die plasmidbasierte AGO2 Expression, welche durch die Flag Modifikation von der endogenen unterscheidbar ist, zeigt keinen signifikanten Anstieg nach miRNA-612 Inhibitorbehandlung im Vergleich zu den kontrollbehandelten Zellen.
Der AGO2 Western Blot (Abbildung III-23 A) mit der zugehörigen AGO2 Western Blot Quantifikationen (Abbildung III-23 B) zeigen, dass das AGO2 Expressionsniveau nach der
Behandlung mit dem miRNA-612-Inhibitor in Mel Juso Zellen auf das 1,3 bzw. 1,7 fache der kontrollbehandelten Zellen ansteigt. Auch nach einer pIRES Transfektion als Kontrollbehandlung zur AGO2 Reexpression zeigt sich ein leichter Anstieg der AGO2 Expression nach der miRNA-612 Inhibitorbehandlung. Jedoch ist die miRNA-612 trotzdem nicht die Ursache für die AGO2 Repression im Melanom. Dies ist daran zu erkennen, dass die Mel Juso Zellen nach einer Behandlung mit einem miRNA-612-Inhibitor und einer vorheriger AGO2 Reexpression keine AGO2 Expressionssteigerung aufweisen im Vergleich zu AGO2-reexprimierten Zellen die mit einem Kontrollinhibitor behandelt wurden. Zudem ist auch keine Steigerung der AGO2 Konzentration in Zellen erkennbar, die mit dem Kontrollinhibitor und 2 µg pMut-612 behandelt wurden im Vergleich zu Zellen die mit dem Kontrollinhibitor und 2 µg pAGO2 behandelt wurden.
Der Flag Western Blot (Abbildung III-23 C) mit der zugehörigen Flag Western Blot Quantifikation (Abbildung III-23 D) analysiert ausschließlich die Plasmid-basierte AGO2 Proteinexpression, da das endogene AGO2 keine Flag-Modifikation aufweist. Es zeigt sich, dass nach miRNA-612-Inhibitorbehandlung die AGO2 Expression etwas höher ist als in den Kontrollinhibitor behandelten Zellen. Diese zeigen jedoch bei 2 µg pMut-612 Transfektion einen geringeren AGO2 Status als die mit pAGO2 transfizierten Zellen, was ebenfalls eine Regulation von AGO2 durch die miRNA-612 widerlegt.