Es gibt prinzipiell zwei Möglichkeiten wie regulierende RNAs in der Therapie verwendet werden können: 1) Zeichnet sich die fehlregulierte miRNA in der Tumorzelle dadurch aus, dass sie eine stärkere Expression zeigt als im gesunden Gewebe, können miRNA Antagonisten das miRNA Transkript binden und durch das RNAi System eliminieren. 2) Ist die fehlregulierte miRNA in ihrer Expression unterdrückt, können miRNA Mimics die reduziert exprimierte miRNA ersetzen und können eine Wirkung als Tumorsuppressor haben (Bader et al. 2010).
Erste Studien konnten in vivo das therapeutische Potential von miRNA-221 und miRNA-222 bezüglich Melanomzellen nachweisen. Die Studien zeigten, dass die Reduktion der beiden miRNAs durch antagomiRs (anti-miRs) das Tumorwachstum in Mäusen reduziert (Felicetti et al. 2008). Es konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass miRNA-let-7 in der miRNA-Replacement-Therapie verwendet werden könnte. Die Transfektion von let-7a pre-miRNAs in Melanomzellen in vitro, hat eine Reduktion des invasiven Potentials zur Folge (Kumar 2003; Muller und Bosserhoff 2008).
Die miRNA-Replacement-Therapie ist jedoch abhängig von einem funktionierenden System zur Translationsinhibition durch miRNAs und somit auch von den AGO Proteinen. Auch anti-miRs sind auf AGOs angewiesen. Anti-miRs benötigen diese jedoch nicht zur Eliminierung der miRNA, sondern binden vorrangig an miRNAs die an den AGO Proteinen komplexiert vorliegen (Hogan et al. 2014).
Die in dieser Dissertation nachgewiesene Reduktion der AGO2 Proteinmenge in Melanomzellen hat Auswirkungen auf die Wirksamkeit einer miRNA-Replacement Therapie, ebenso wie auf eine anti-miR Therapie. Diese Schlussfolgerung kann durch den Zusammenhang der geringeren AGO2 Verfügbarkeit und der daraus resultierenden geringeren Effektivität von regulatorischen RNAs im Melanom gezogen werden.
Jedes der vier humanen AGOs ist zur Inhibition der Translation befähigt. Jedoch ist die direkte mRNA Degradation dem AGO2 vorbehalten (Meister et al. 2004). Diese direkte Degradation durch AGO2 erfolgt immer dann, wenn die Seed-Sequenz der miRNA vollständig komplementär zum Gentranskript ist (Rand et al. 2005; Leuschner et al. 2006). Erstaunlicherweise erfolgt jedoch keine sequenzbezogene Diskriminierung der miRNAs für ein spezielles AGO bei der miRNA-Beladung des RISC (Meister et al. 2004). Somit ist die AGO2 Reduktion im Melanom vor allem für die mRNAs relevant, die eine vollständige Komplementarität gegenüber der miRNA aufweisen. Für diese
Gentranskripte würde als Folge die Wahrscheinlichkeit steigen durch ein nicht-restriktionsaktives AGO inhibiert zu werden, trotz vollständiger Sequenzübereinstimmung zur miRNA. Dies lässt schlussfolgern, dass die zellspezifische Häufigkeit der vier AGO Proteine eine Spezialisierung der Zelle für die miRNA basierte Degradation der Gentranskripte darstellt. Nach dem derzeitigen Kenntnissstand ist dieser Ansatz jedoch nur eine Theorie und bedarf zur Bestätigung noch intensiver Forschungsarbeit.
Neuere Studien zeigen, dass neben dem guide auch der passenger Strang einer miRNA Duplex in den RISC eingebunden werden kann und dort aktiv ist. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass eine Modulation der thermodynamischen Stabilität der miRNA Duplex Enden zu einer Änderung der guide und passenger Strang Festlegung führen kann. Jedoch ist dieses Phänomen bisher nur an AGO2 beobachtet worden, wohingegen AGO3 keine Änderung der Strang Diskriminierung zulässt (Winter und Diederichs 2013). Der passenger Strang der von Winter et al.
analysierten miRNA-let7a weist dabei eine starke Präferenz für eine Prozessierung durch AGO3 auf, wobei die molekularen Mechanismen dieser Selektion noch nicht vollständig verstanden sind (Winter und Diederichs 2013). Das Verständnis für die molekularen Mechanismen, sowohl bei der Festlegung einer miRNA auf ein AGO bei der Beladung des RISC, als auch zur Festlegung des guide und passenger Strangs, bedürfen noch intensiver Forschungsarbeit. Hinsichtlich einer RNA basierten Therapiemodalität könnte diese Forschung potentiell klinisch relevant werden.
Versuche und Studien mit örtlich dargereichten siRNAs, d.h. durch lokale Gabe z.B. durch eine Inhalation für das Zielorgan Lunge (Bitko et al. 2005) oder durch eine oberflächliche Anwendung für einen Einsatz in der Region Haut (Geusens et al. 2009) sind vielversprechend, jedoch nicht geeignet für einen Therapieansatz gegen ein metastasierendes Melanom. Hierfür wäre nur ein systemisch basierter siRNA Ansatz geeignet, da alle Metastasen in allen Regionen des Körpers erreicht werden müssten (Zimmermann et al. 2006). Ein solcher Ansatz kann nur funktionieren, wenn die therapeutische RNA ihren Wirkungsort erreicht und dort auch effektiv funktioniert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass aufgrund der AGO2 Reduktion in Melanomzellen die Effektivität von regulatorischen RNAs gesenkt ist. Für die systemische Behandlung eines Melanoms müssten daher höhere Dosen der therapeutischen RNA verabreicht werden. Um die Dosis der therapeutischen RNA in der Therapie so gering wie möglich zu halten wäre es nötig, die Effektivität der therapeutischen RNA in den Melanomzellen zu erhöhen. Dies wäre in der Theorie machbar wenn durch eine Gentherapie die AGO2 Proteinmenge in den Melanomzellen wieder gesteigert werden würde.
Bei der Gentherapie wird ein defektes oder inaktives Gen kompensiert, indem die fehlende genetische Information des Gens in die Zelle therapeutisch eingebracht wird (Misra 2013). Dabei
lässt sich zwischen dem ex vivo- und in vivo-Gentransfer unterscheiden. Der ex vivo-Gentransfer zeichnet sich dadurch aus, dass die Zellbehandlung ausserhalb des Körpers erfolgt und erst die erfolgreich behandelten Zellen in den Körper zurückgegeben werden. Bei dem in vivo-Gentransfer wird die Behandlung direkt im Körper durchgeführt (Madeddu 2005). Für eine Gentherapie zur Steigerung der AGO2 Konzentration im metastasierenden Melanom würde sich nur ein in vivo-Gentransfer eignen um alle Metastasenzellen zu behandeln. Jedoch zeigen die Versuche der AGO2 Reexpression im Zellkultursystem in dieser Dissertation, dass die AGO2 Proteinexpression mit den verwendeten Methoden nur sehr eingeschränkt in einer Melanomzelle gesteigert werden kann. Durch den Nachweis, dass miRNAs für die AGO2 Repression verantwortlich sind, könnte daher die Inhibition der AGO2 reprimierenden miRNA einen erfolgsversprechenderen Lösungsweg im Vergleich zur AGO2 Gentherapie darstellen. Dazu wären weitere Studien nötig um die miRNAs zu identifizieren, die für die AGO2 Reduktion in den Melanomzellen verantwortlich sind, und somit im Anschluss eine effiziente RNA basierte Therapie für das Melanom zu ermöglichen.
Zusammenfassend betrachtet hat dieser Aspekt der Arbeit gezeigt, dass eine RNA basierte Therapie prinzipiell eine Möglichkeit für eine systemische Behandlung eines metastasierenden Melanoms darstellen könnte. Die in dieser Dissertation beschriebene Reduktion von AGO2 im Melanom, mit einer darauf beruhenden gesenkten Effektivität von regulatorischen RNAs, stellt für eine RNA basierte Therapie jedoch noch eine große Hürde dar. Durch weitere Studien könnte diese Hürde vielleicht genommen werden, z.B. durch die Identifikation der miRNAs die für die AGO2 Reduktion verantwortlich sind.
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Bio-Rad, München Immun-BlotTMPVDF Membran, Precision
Plus Protein™ Standard Kaleidoscope™
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Invitrogen, Carlsbad, USA Lipofectamine LTX™ Reagent, Lipofectamine RNAiMAX ™ Reagent, SuperScript™ II Reverse Transcriptase Kit,
Ready-Load™ 100bp und 1kb DNA Ladder; Geneticin
Neuro Probe, Gaithersburg, USA Polykarbonat-Membranen für Boydenkammer (Porengröße 8μm) New England Biolabs, Ipswich, USA Restriktionsendonukleasen, NEBuffer für
Restriktionsenzyme, T4 DNA Ligase, Antarktische Phosphatase, NEB 10-beta Competent E.coli
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