Regulierbare Promotoren

Kandidaten mit einem hitzesensitiven (ts) Phänotyp näher untersucht. Aus allen potentiellen Kandidaten wurden die Plasmide isoliert und in den shuffle Stamm re-transformiert. Erstaunlicherweise waren bei der Re-Transformation einige der Kandidaten schon bei der 5’-FOA Selektion tot, bei den Überlebenden konnte nur ein schwach ausgeprägter ts- (Daten nicht gezeigt) bzw. cs-Phänotyp (Abb. 2.5) beobachtet werden.

Abb. 2.5: Re-Transformation der Kandidaten Plasmide Wachstumstest zur Verifizierung von kältesensitiven (cs) Phänotypen. Dazu wurden die Plasmide aus den gefundenen cs-Kandidaten-Stämmen isoliert und in den shuffle Stamm zurücktransformiert. Nach der Selektion mit 5’-FOA wurden die betreffenden Stämme auf YEPD-Medium aufgetragen und bei 20°C und 30°C inkubiert. Die Abbildung zeigt den schwach ausgeprägter cs-Phänotyp einiger Kandidaten bei 20°C im Vergleich zu Wildtypzellen.

Trotz mehrfacher Versuche eine ts-Mutante herzustellen, gelang es nicht durch eine Re-Transformation der gefundenen potentiellen ts/cs-Plasmide aus den Kandidaten einen ts-Stamm mit stark ausgeprägten Phänotyp zu generieren (Abb. 2.5). Mit Hilfe der Integration einiger ts-Allele in das RLI1 Allel konnte ein starker ts-Phänotyp generiert werden, der sich jedoch in späteren Versuchen als genetisch instabil herausstellte (Abb. 2.4).

Gal-Promotoren werden durch Glukose (Glc) gehemmt und der Tet^off-Promotor wird durch Zugabe von Doxycyclin reprimiert.

2.3.1 Galaktose-Promotoren

Die für RLI1 codierende Sequenz wurde hierzu unter die Kontrolle eines Gal1-10, Gal-L oder Gal-S Promotors kloniert. Die verwendeten Gal-Promotoren unterscheiden sich in ihrer Expressionstärke und Reprimierbarkeit (Janke et al., 2004). Die Plasmide wurden anschließend in den RLI1 shuffle Stamm transformiert, und durch Selektion mit 5’-FOA wurde das WT-Plasmid entfernt. Die Zellen konnten nun nur noch in Gal-Medium kultiviert werden, was durch einen Wachstumstest gezeigt werden konnte (Daten nicht gezeigt). Das Abschalten des Promotors erfolgte dann durch Kultivierung der Zellen in Vollmedium, wobei zu verschiedenen Zeitpunkten ein Aliquot der Kultur entnommen wurde und mittels Western Blot Analyse auf den Rli1p-Gehalt untersucht wurde. Als Kontrolle für einen gleichmäßigen Proteingehalt in den jeweiligen Proben wurde Aktin verwendet. Die schnellste Depletion wurde bei Verwendung des Gal-S Promotors erzielt (Abb. 2.6).

Der Western Blot in Abb. 2.6 zeigt, dass der Abbau von Rli1p sehr langsam erfolgte.

Abb. 2.6: Glukose-Repression

Western Blot verschiedener Zeitpunkte nach einer Glukose Repression des Promotors.

RLI1 wurde unter die Kontrolle eines Gal-Promotors kloniert und in den rli1 Knockout transformiert. Der so hergestellte Stamm wurde über Nacht in Gal-Medium kultiviert und dann in Vollmedium überführt. Nach 1-6 h, 8 h und 24 h wurde je ein Aliqout der Kultur entnommen, Zellextrakte hergestellt und mit einem Western Blot analysiert. Der Rli1p Gehalt wurde mit einem α-RLI1-Antikörper, der Gesamt-Proteingehalt wurde mit Hilfe von Aktin bestimmt.

Erst 6 h nach Zugabe des Repressors wurde eine Reduktion des Rli1p Signals auf ungefähr 50 % beobachtet, jedoch war auch noch nach 24 h ein deutliches Signal auf dem Western Blot detektierbar. Die Aktin-Ladekontrolle ist nicht so gleichmäßig wie erwartet, sie zeigt aus experimentellen Gründen auch eine Abnahme bei den Zeitpunkten 8 h und 24 h, was dafür spricht dass das Rli1p-Signal eigentlich noch stärker ist als in Abb. 2.6 gezeigt. Aufgrund dieses langsamen Abbaus von Rli1p war

dieses System in Hinsicht auf die Generationszeit von S. cerevisiae (ca. 2 h) zur weiteren Untersuchung ungeeignet.

2.3.2 Tet

-Promotor

Um einen schnelleren Abbau von Rli1p zu erreichen, wurde ein Tet^off-Promotor verwendet. Dies ist ein Promotor, der besser reprimierbar ist und zudem abhängig von der Konzentration des zugegebenen Hemmstoffes stufenweise reguliert werden kann. Dazu wurde die für RLI1 codierende Sequenz unter die Kontrolle eines Tet^off -Promotors kloniert und in den rli1 Knockout, mit Hilfe des shuffle Stamms, transformiert. Die Expression wurde durch Zugabe von Doxycyclin reprimiert. Der Abbau von Rli1p wurde anhand eines Western Blots nach verschiedenen Zeitpunkten nach der Promotor-Repression analysiert (Abb. 2.7).

Abb. 2.7: Doxycyclin-Repression

Western Blot verschiedener Zeitpunkte nach einer Doxycyclin-Repression des Tet^off -Promotors. RLI1 wurde unter die Kontrolle eines Tet^off-Promotors kloniert und in den rli1 Knockout transformiert. Der so hergestellte Stamm wurde in Medium mit 2 µg/µl Doxycyclin überführt. Nach 0-8 h, 24 h, 32 h und 48 h wurde je ein Aliqout der Kultur entnommen, Zellextrakte hergestellt und mit einem Western Blot analysiert. Der Rli1p Gehalt wurde mit einem α-RLI1-Antikörper, der Gesamt-Proteingehalt wurde mit Hilfe von Aktin bestimmt.

Abb. 2.7 demonstriert, dass der Abbau von Rli1p wesentlich schneller erfolgte als mit den in Abschnitt 2.3.1 verwendeten Gal-Promotoren. Nach ca. 5 bis 6 h beobachtete man eine deutliche Abnahme der Rli1p Konzentration, der vollständige Abbau des Proteins wird nach 7 bis 8 h erreicht. Verglichen mit der Generationszeit von Hefe (ca. 2 h), ist dies immer noch ein zu langer Zeitraum und somit ist keines der Systeme geeignet, um pathologische Prozesse bei Rli1p-Verlust zu untersuchen.

2.3.3 Degradation mit einer UBI-R Destruktions-Markierung

Eine Alternative zu einer einfachen Promotor-Repression ist der schnellere Abbau eines Proteins, der mit Hilfe einer so genannten Destruktions-Markierung erreicht

werden kann (Varshavsky, 1996). Abb. 2.8 zeigt die dafür notwendige Aminosäuresequenz, die N-terminal an das Zielprotein fusioniert wird und damit durch das Ubiquitin/Proteasom-System erkannt und abgebaut wird. Diese UBI-R Markierung besteht aus einem abspaltbarem Ubiquitin (UBI), einem N-terminalen, destabilisierenden Arginin und zwei Lysinen, die an den Aminosäure-Positionen 15 und 17 lokalisiert sein müssen. Zudem ist deren Abstand zum Zielprotein wichtig, ein Linker von ungefähr 30 Aminosäuren führt zur optimalen Erkennung durch das Ubiquitin/Proteasom-System. Die in Abb. 2.8 dargestellte Aminosäuresequenz wurde N-terminal an Rli1p fusioniert und durch Kombination mit einem reprimierbaren Gal-Promotor soll erreicht werden, dass kein neues Protein mehr gebildet wird. Das in den Zellen bereits vorhandene markierte Zielprotein wird von dem Ubiquitin/Proteasom-System erkannt und abgebaut. Abb. 2.8 zeigt das Ergebnis für den Abbau des Rli1p-Fusionsproteins anhand eines Western Blots nach verschiedenen Zeitpunkten nach der Hemmung des Promotors.

Abb. 2.8: Abbau von Rli1p mit Hilfe der UBI-R Destruktions-Markierung

Die oben dargestellte Aminosäuresequenz wurde N-terminal an Rli1p fusioniert, in einen mit Glc-reprimierbaren Vektor kloniert und anschliessend in den rli1 Knockout transformiert. Der so hergestellte Stamm wurde über Nacht in Gal-Medium kultiviert und dann in Glc-Medium überführt. Nach 0-4 h, 6 h, 8 h und 23 h wurde je ein Aliqout der Kultur entnommen, Zellextrakte hergestellt und mit einem Western Blot analysiert. Der Rli1p Gehalt wurde mit einem α-RLI1-Antikörper bestimmt.

Auch mit diesem System konnte kein schnellerer Abbau von Rli1p erreicht werden (Abb. 2.8). Auf dem Western Blot sind zwei Signale zu erkennen, eines bei ca. 90 kDa, das dem UBI-R-Rli1p Fusionsprotein entspricht. Das zweite Signal bei 68 kDa, entspricht Rli1p nach Abspaltung des ca. 30 kDa großen UBI, welches nach der N-end Regel (Varshavsky, 1996) abgebaut werden soll (Abb. 2.8). Erst nach 6 h und 8 h nach Zugabe des Repressors wurde eine deutliche Abnahme des Rli1p-Signals

beobachtet. Die Geschwindigkeit des Abbaus eines UBI-R-Rli1p Fusionsproteins unterscheidet sich deshalb nicht wesentlich von der Degradation, die mit einem Tet^off-Promotor erreicht wurde (vgl. Abb. 2.7).