Identifizierung der Interaktionspartner von Rli1p

Um auszuschließen, dass der Bindungsverlust von eIF3 Untereinheiten durch die TAP-Reinigung selbst bzw. den zweiten Affinitätsschritt herbeigeführt wird, wurde zum Vergleich die Reinigung des eIF3-Komplexes am Beispiel von TAP-markierten Nip1p durchgeführt. Das Ergebnis der NIP1-TAP Reinigung ist in Spur 1 und 3 dargestellt. Neben allen co-gereinigten eIF3-Untereinheiten (Rpg1p, Prt1p, Tif34p, Tif35p und Hcr1p) waren noch weitere prominente Banden auf dem Gel zu sehen, die wahrscheinlich andere Initiationsfaktoren, wie eIF2 und eIF5 repräsentieren.

Diese Banden wurden jedoch nicht sequenziert. Es zeigte sich, dass unter den verwendeten Bedingungen eIF3 sowie weitere Komponenten des Multifaktor Komplexes stabil gereinigt werden konnten. Somit ist der Bindungsverlust von Nip1p, Tif34p und Tif35p in einer RLI1-TAP Reinigung nicht durch die Methode zu erklären.

Zudem konnte anhand der Bandenintensität demonstriert werden, dass nur ein geringer Anteil von eIF3 mit Rli1p assoziiert vorliegt. Ein Western Blot des NIP1-TAP EGTA-Eluats zeigte, das Rli1p co-gereinigt werden kann (Daten nicht gezeigt), jedoch nicht als stöchiometrische Untereinheit, da keine zu den eIF3 Untereinheiten vergleichbar starke Proteinbande auf dem Coomassie-Gel sichtbar ist. Die gefundenen Interaktionen von Rli1p wurden auch mit Hilfe der Co-Immunopräzipitation mit markierten eIF3-Untereinheiten (Prt1p-HA, Nip1p-HA, Hcr1p-HA und Tif34p-HA) bestätigt. In allen Fällen konnte eine Interaktion mit Rli1p nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).

2.7.1 Bedingungen für die Bindung an eIF3 und Ribosomen

Da Rli1p eine ATPase ist, sollte anschließend untersucht werden, ob die Bindung an den Translationsinitiationsfaktor eIF3 und an ribosomale Proteine ATP-abhängig erfolgt. Da die gefundenen Interaktionspartner von Rli1p, eIF3 und Ribosomen, große RNA-Protein Komplexe bilden, wurde auch der Einfluss von RNA auf die Bindung untersucht. Um eine ATP-Abhängigkeit zu zeigen, wurden nach der Bindung an IgG-Sepharose die gebundenen Komplexe entweder mit ortho-Vanadat oder mit Apyrase behandelt. Ortho-Vanadat ist ein Analog des anorganischen Phosphates und arretiert einen Enzymzustand während der ATP Hydrolyse. Die ATPase verbleibt in einer ADP-gebundenen Form. Wohingegen Apyrase ATP in ADP und AMP spaltet.

Für die RNA-Abhängigkeit wurde der gebundene Komplex mit RNase A, einer Endonuklease, behandelt. Um nicht mehr gebundene Interaktionspartner zu entfernen, wurde ein Waschschritt eingeführt, bevor Rli1p-TAP mit TEV-Protease

eluiert wurde. Die Proteine, die nach der jeweiligen Behandlung immer noch mit Rli1p-TAP assoziiert vorliegen sind in Abb. 2.15 dargestellt.

Abb. 2.15: Bindung von Rli1p an eIF3 ist RNA abhängig.

SDS-PAGE Analyse einer Rli1p-TAP Reinigung unter ATP- und RNA-limitierenden Bedingungen. Dargestellt sind die TEV-Eluate nach dem ersten Affinitätsschritt. Nach der Bindung an das Säulenmaterial wurden die gebundenen Rli1p-Komplexe mit ortho-Vanadat (Spur 1), Apyrase (Spur 2) und RNaseA (Spur 3) behandelt. Spur 4 zeigt die Kontrollreinigung ohne Behandlung.

Abb. 2.15 zeigt, dass die Bindung von Rli1p an Ribosomen und eIF3 unter diesen Bedingungen ATP-unabhängig erfolgte. Weder die mit ortho-Vanadat (Spur 1) noch mit Apyrase behandelten (Spur 2) Rli1p-Komplexe zeigten einen Unterschied zur Kontrollreinigung (Spur 4). Eine RNA-Abhängigkeit der Interaktion konnte für die Reinigung mit RNase A behandelten Komplexe nachgewiesen werden (Spur 3). Im Vergleich zur Kontrollreinigung war deutlich weniger Rpg1p, Nip1p und Prt1p gebunden. Auch die Assoziation mit Tif34p wurde beeinflusst, die Menge an co-gereinigtem Protein nahm ebenfalls ab. Die Bindung zu Tif35p konnte nicht mehr nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu wurde die Bindung von Rli1p an Hcr1p und an die ribosomale Proteine durch die RNaseA-Behandlung nicht beeinflusst. Um diesen Bindungsverlust der Interaktionspartner näher untersuchen zu können, wurde das Laufverhalten des Rli1p-Komplexes in einem 20-40 % Glycerol-Gradienten aufgezeigt. Die Zellextrakte wurden mit Apyrase und RNase A behandelt, aufgetrennt und die Verteilung von Rli1 in diesem Gradienten mit einem Western Blot sichtbar gemacht.

Abb. 2.16: Glycerol-Gradienten mit RNA- und ATP-limitierenden Bedingungen.

Western Blot Analyse der Glycerol-Gradienten der unbehandelten (Kontrolle), der mit RNase A und mit Apyrase behandelten Zellextrakte. Die Auftrennung erfolgte mit einem linearen 20 % bis 40 % Glycerol-Gradienten. Die eingezeichneten Molekulargewichte markieren das Laufverhalten von Markerproteinen.

Wie in Abb. 2.15 gezeigt wurde, führte eine RNaseA-Behandlung zu einem Verlust der Interaktionspartner Rpg1p, Nip1p, Prt1p und Tif35p (351 kDa). Aus diesem Grund wurde auch nach einer RNaseA-Behandlung im Gradient ein leichterer Rli1p enthaltender Komplex erwartet. Es konnte jedoch nur eine minimale Verschiebung des Rli1p-enthaltenden Komplexes in die leichteren Fraktionen beobachtet werden (Abb. 2.16). Ein Grund hierfür könnte sein, dass für die Gradienten Zellextrakte verwendet wurden, die eine höhere RNA-Konzentration aufwiesen als die gereinigten Komplexe (Abb. 2.15). Bei gleicher Menge an eingesetzter RNaseA kann so wahrscheinlich kein vollständiger Verlust der Bindungen zu den Interaktionspartnern erreicht werden.

Durch die Apyrase-Behandlung zeigte sich eine deutliche Veränderung des Laufverhaltens der Rli1p enthaltenden Komplexe in die leichteren Fraktionen. Eine Anreicherung von Rli1p, wurde vor allem in einem Bereich von 200-600 kDa beobachtet. Aufgrund der Ergebnisse der Reinigung (Abb. 2.15) wurde dies nicht erwartet, da die Apyrase-Behandlung nicht zu einem Bindungsverlust von Interaktionspartnern führte. Für die Glycerol-Gradienten (Abb. 2.16) wurden jedoch Zellextrakte verwendet und keine gereinigten Komplexe, auf die möglicherweise die Apyrase keinen Effekt hat. Dieses Experiment demonstrierte, dass eine ATP-Depletion durch Apyrase in Zellextrakten zu einem kleineren Rli1p enthaltenden Komplex führte.

2.7.2 Bindung von rRNA an Rli1p

Die Behandlung mit RNaseA zeigte, dass die Bindung von Rli1p zu eIF3 teilweise über RNA vermittelt wird (Abb. 2.15). Zur Identifizierung der RNA im Rli1p-Komplex wurde eine TAP-Reinigung durchgeführt, die RNA aus dem EGTA-Eluat isoliert und mit einem Northern Blot analysiert (Abb. 2.17). Als Positiv-Kontrolle wurde RNA von Zellextrakten und aus dem Eluat einer Nip1p-TAP Reinigung isoliert. Als Negativ-Kontrolle wurde eine Reinigung mit einem Wildtyp-Stamm durchgeführt, um unspezifische Bindung von RNA an die IgG-Sepharose auszuschließen. Da Rli1p mit Ribosomen interagiert (Abb. 2.14), lag es nahe dass es sich bei der RNA um ribosomale RNA handelte. Es wurden Sonden gegen die 20S und 18S rRNA der 40S ribosomalen Untereinheit gewählt, wobei die 20S rRNA ein Vorläufer der 18S rRNA ist.

Abb. 2.17: rRNA Assoziation mit dem Rli1p Komplex.

A) Proteingel der EGTA-Eluate von Nip1p-TAP, Rli1p-TAP und der Mock Reinigung. B) Links: Methylenblaufärbung der transferierten RNA. Die Pfeile markieren die Positionen der 25S und 18S rRNA. Rechts: Autoradiographie der Membran inkubiert mit einer Sonde gegen 18S rRNA. C) Links: Methylenblaufärbung der transferierten RNA. Die Pfeile markieren die Positionen der 25S und 18S rRNA. Rechts: Autoradiographie der Membran inkubiert mit einer Sonde gegen 20S rRNA.

Die TAP-Reinigungen von Nip1p, Rli1p und des Wildtyp-Stamms sind anhand eines Proteingels in Abb. 2.17 A gezeigt. Damit konnte demonstriert werden, dass die Komplexe in ausreichenden Mengen und ohne zusätzliche unspezifische Proteine gereinigt werden konnten. Die aus den Eluaten isolierte RNA wurde dann über ein Formaldehyd-Gel aufgetrennt, und auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Die Methylenblaufärbung wies den erfolgreichen Transfer der RNA nach, bevor mit den radioaktiv markierten 18S-(Abb. 2.17 B) und 20S-(Abb. 2.17 C) Oligo-Sonden hybridisiert wurde. Überraschenderweise sah man bereits mit der relativ unsensitiven Methylenblaufärbung ein deutliches 18S Signal für die RNA, die aus dem Nip1p-TAP Eluat isoliert wurde. Nach der radioaktiven Markierung konnte für die eIF3-Reinigung mit beiden verwendeten Sonden ein Signal nachgewiesen werden. Für das Eluat der Rli1p-Reinigung konnte nur ein sehr schwaches Signal für die 18S rRNA detektiert werden, was mit der Menge an co-reinigenden Ribosomen übereinstimmt. Das Ergebnis demonstrierte, dass Rli1p mit 18S rRNA interagiert, ob es sich dabei um eine direkte Interaktion oder über eine eIF3/ribosomale Proteine vermittelte Interaktion handelt blieb unklar.