Regulation des Stickstoffmetabolismus

Zum besseren Verständnis des Modells zur Wahrnehmung von Riboflavin wird hier zunächst auf Regulationen in S. cerevisiae in Abhängigkeit von der Qualität der vorhandenen Stickstoffquellen eingegangen.

4.2.1.1 Allgemeines

Bäckerhefe ist in der Lage, eine Vielzahl von Stickstoffquellen für das Wachstum zu nutzen, jedoch können nicht alle dieser N-Quellen gleich gut verwertet werden. Als gute Stickstoffquellen dienen der Bäckerhefe Ammonium, Glutamin und Asparagin, während Harnstoff und Prolin schlechte Quellen sind. In Hefe erfolgt die Stickstoff-Assimilation prinzipiell über Glutamin und Glutamat (Cooper 1982; Magasanik 1992; Wiame et al. 1985).

Glutamat kann direkt aus Ammonium durch die NADPH-abhängige Glutamat-Dehydrogenase synthetisiert werden (Nagasu und Hall 1985). Diese Umsetzung wird von Gdh1p (im Cytosol) und Gdh3p (in den Mitochondrien) unabhängig katalysiert (DeLuna et al.

2001). Die Glutamin-Synthetase Gln1p stellt (im Cytosol) Glutamin aus Ammonium und Glutamat her (Mitchell und Magasanik 1983; Mitchell und Magasanik 1984).

Die Umsetzung von Asparagin in Aspartat und Ammonium erfolgt durch die Asparaginasen Asp1p und Asp3p im Cytosol (Kim et al. 1988; Sinclair et al. 1994). Harnstoff wird in zwei Schritten zu Ammonium abgebaut. Im ersten Schritt wird Harnstoff zu Allophansäure und diese im zweiten Schritt zu Ammonium und CO2 umgesetzt. Dieser Abbau wird durch das bifunktionelle und biotinabhängige Enzym Dur1,2p im Cytosol katalysiert (Cooper et al.

1980).

Die Degradation von Prolin zu Glutamat erfolgt in drei Schritten in den Mitochondrien (Brandriss und Krzywicki 1986; Cooper 1982; Krzywicki und Brandriss 1984). Zunächst wird Prolin durch die FAD-abhängige Prolinoxidase (Put1p) zu Δ-Pyrrolin-5-Carboxylat (P5C) oxidiert (Wang und Brandriss 1987), welches im zweiten Schritt unkatalysiert zu Glutamatsemialdehyd umgesetzt wird. Glutamatsemialdehyd wird dann im letzten Schritt durch die P5C-Dehydrogenase (Put2p) zum verwertbaren Glutamat degradiert (Brandriss 1983).

Wie bereits erwähnt, können nicht alle Stickstoffquellen gleich gut verwertet werden. Aus diesem Grund suchen sich Hefezellen die jeweils beste der verfügbaren Stickstoffquellen über den Mechanismus der Stickstoffkatabolitrepression („nitrogen catabolite repression“, NCR) aus. Der NCR beinhaltet einige Mechanismen zur Wahrnehmung der vorhandenen Stickstoffquellen und reguliert sowohl deren Aufnahme über die Plasmamembran als auch weitere Degradationsgene (Cooper und Sumrada 1983).

Wenn gute Stickstoffquellen zur Verfügung stehen, wird sowohl die Expression der Gene, die für den Import schlechterer Stickstoffquellen benötigt werden als auch der für die Degradation von Harnstoff und Prolin zu Glutamin bzw. Glutamat verantwortlichen Gene, reprimiert (Cooper und Sumrada 1983).

4.2.1.2 Regulation des Prolinmetabolismus

Da das Modell zur Wahrnehmung von Riboflavin in engem Zusammenhang mit der Verwertung von Prolin steht, wird im Folgenden auf die Regulation der Prolinaufnahme und der Prolindegradation eingegangen.

Die Aufnahme von Prolin über die Plasmamembran erfolgt hauptsächlich über das für Prolin niedrigaffine Transportprotein Gap1p und den hochaffinen Transporter Put4p (Jauniaux und Grenson 1990; Jauniaux et al. 1987). Neben den bereits genannten Transportern konnten auch für weitere Proteine die Fähigkeit zum Import von Prolin gezeigt werden. Dabei handelt es sich um die Proteine Agp1p (high-affinity glutamine permease 1) und Gnp1p (glutamine permease 1) die über das Plasmamembran-Wahrnehmungssystem für Aminosäuren (SPS) induziert werden (Andreasson et al. 2004). Diese Proteine transportieren Prolin nur mit einer niedrigen Affinität und haben ein breites Substratspektrum.

Während des Wachstums auf Prolin wird diese Aminosäure hauptsächlich durch Gap1p und Put4p aufgenommen. Die Aktivität dieser Transportproteine wird durch ihren Phosphorylierungsstatus reguliert. Sobald für in Prolin angezogene Zellen eine bessere Stickstoffquelle verfügbar ist, werden Gap1p und Put4p durch Dephosphorylierung inaktiviert (Stanbrough und Magasanik 1995), um die Aufnahme der schlechteren Stickstoffquelle zu vermeiden. Die dephosphorylierten Permeasen werden durch die Ubiquitin-Protein-Ligase Npi1p ubiquitiniert, wodurch die Degradation induziert wird (Grenson 1992). Die Transkription der Transportgene Gap1p und Put4p wird in Anwesenheit von Ammonium, Glutamat, Glutamin und Asparagin inhibiert.

Prolin induziert die Expression der Prolindegradationsgene PUT1 und PUT2 durch die Aktivierung des Transkriptionsfaktors Put3p, wodurch Prolinoxidase und Δ− Pyrrolin-5-carboxylat-Dehydrogenase synthetisiert werden (Brandriss 1983; Brandriss 1987; Wang und Brandriss 1986). Diese Enzyme werden in die Mitochondrien importiert und katalysieren dort die Umsetzung von Prolin in Glutamat (Kaput et al. 1989; Krzywicki und Brandriss 1984;

Wang und Brandriss 1987).

Der Transkriptionsfaktor Put3p wird sowohl für die Transkription von PUT1 als auch von PUT2 benötigt (Brandriss 1987; Marczak und Brandriss 1991). Die Transkription und Translation von PUT3 erfolgt jedoch unabhängig von den vorhandenen Stickstoffquellen (Marczak und Brandriss 1989). Put3p bindet zudem unabhängig von der Stickstoffquelle an die Put3p-Transkriptionsfaktorbindestellen der Promotoren sowohl von PUT1 als auch von PUT2. Die Transkription der Gene wird allerdings nur in Gegenwart von Prolin und in Abwesenheit einer bevorzugten Stickstoffquelle aktiviert (Axelrod et al. 1991; Marczak und

Brandriss 1989; Siddiqui und Brandriss 1988). Die Aktivierung der Transkription der Put3p-regulierten Gene erfolgt durch eine Konformationsänderung, die das bereits an die DNA gebundenen Put3p durch Bindung von Prolin erfährt (Des Etages et al. 2001). In Abbildung 4-2 ist die Regulation der Prolindegradation schematisch dargestellt.

Abb. 4-2: Regulation der Prolindegradation. Intrazelluläres Prolin stimuliert den Transkriptionsfaktor Put3p, wodurch die Synthese der Prolindegradationsproteine Put1p und Put2p aktiviert wird. Diese Proteine werden in die Mitochondrien transportiert und katalysieren dort die Umsetzung von Prolin zu Glutamat. Aus Ter Schure et al. (2000) In dieser Abbildung sind die Transportproteine Agp1p und Gnp1p nicht dargestellt.

Der Abbau von Prolin erfolgt in E. coli und Salmonella thyphimurium (S. thyphimurium) über das multifunktionelle Protein PutA. Dieses Protein besitzt sowohl Prolinoxidase- als auch P5C-Dehydrogenaseaktivität (Menzel und Roth 1981). Das multifunktionelle Flavoprotein fungiert einerseits als Repressor der Transkription von putA und putP (dem Gen das für den Membrantransporter für Prolin kodiert) und andererseits als Enzym des Prolinabbaus. In Abwesenheit von Prolin verbleibt PutA im Cytoplasma, wo es an den Operator des put-Operons bindet und die Genexpression verhindert. Wenn PutA Prolin bindet, assoziiert es mit der Plasmamembran, wo es den Abbau von Prolin katalysiert. Die beim Abbau von Prolin frei werdenden Elektronen werden auf FAD übertragen und von dort direkt in die membran-gebundene Elektronentransportkette eingespeist. Durch die Bindung von PutA an die Plasma-membran sinkt sein Anteil im Cytoplasma, wodurch die Bindestellen am Operator des put-Operons frei werden und somit die Expression dieser Gene ermöglicht wird (Ostrovsky de Spicer und Maloy 1993). Von Surber und Maloy (1999) wurde beschrieben, dass die Bindung von PutA an die Membran durch eine Konformationsänderung bedingt wird. Diese erfolgt durch reduziertes kovalent gebundenes FAD. Durch die Reduktion von FAD wird die Hydrophobizität von PutA erhöht, wodurch es an die Membran gebunden werden kann.