Proteinbiochemische Methoden

2.2.3 Proteinbiochemische Methoden

2.2.3.1 Proteinbestimmung

Die Proteinbestimmung erfolgte nach der Methode von Bradford (1976). Für diese Bestimmung wurde die Proteinlösung zur Bradfordlösung gegeben und für 5 min stehen gelassen. Die Extinktion des Reaktionsprodukts wurde bei 595 nm im Photometer gemessen.

Die Quantifizierung der Proteinmenge erfolgte über eine Kalibriergerade, die mit BSA-Lösungen im Reaktionsansatz erstellt wurde.

a b c

d

e f g

2.2.3.2 Isolierung von Proteinen

Die Isolierung von Proteinen erfolgte immer auf Eis, mit gekühlten Lösungen und in gekühlten Zentrifugen. Als Proteaseinhibitor wurde immer eine 100 mM PMSF-Lösung verwendet.

Gesamtproteinextraktion:

Die Zellen wurden üN in Minimalmedium oder YPD angezogen. Es wurden je Kultur 5 OD Zellen geerntet und mit TE (Prot) gewaschen. Zu dem Zellpellet wurden ca 0,1 g Glasperlen, 100 µl SDS-Probenpuffer (1x) und 1 µl PMSF gegeben. Der Ansatz wurde im Ribolyser für 30 sec auf Stufe 5 geschüttelt. Die Proben wurden für 5 min auf 42 °C (Membranproteine) oder auf 95 °C erhitzt.

Membranproteinextraktion:

Die Zellen wurden auf eine OD600 von 1 bis 2 angezogen und 40 ODgeerntet. Die Zellen wurden mit TE (Prot) gewaschen, in 200 µl TE (Prot) resuspendiert, Glasperlen und 1 µl PMSF zugegeben und im Ribolyser für 30 sec bei Stufe 5 aufgebrochen. Zu der Suspension wurde 1 ml TE (Prot) gegeben und für 3 min bei 3000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt, 1 µl PMSF zugegeben und für 20 min bei 14000 rpm zentrifugiert. Der Überstand enthielt die löslichen Proteine und das Pellet die Membranproteine. Das Pellet wurde in 100 µl TE mit 1 µl PMSF aufgenommen.

2.2.3.3 TCA-Fällung von Proteinen

In einem Reaktionsgefäß wurden 200 µl 100 % TCA vorgelegt, 1 ml Proteinlösung zugegeben. am Vortex gemischt und für 30 min auf Eis gestellt. Dann wurde für 15 min bei 4 °C und 14000 rpm zentrifugiert und der Überstand verworfen. Es wurden 200 µl 1 M Tris zugegeben, pelletiert, nochmal mit 1 ml kaltem Aceton gewaschen und wieder pelletiert. Der Überstand wurde abgenommen, das Pellet getrocknet, 60 µl SDS-Probenpuffer zugegeben und die Probe für 5 min auf 42 °C (Membranproteine) oder auf 95 °C erhitzt.

2.2.3.4 Auftrennung und Nachweis von Proteinen SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE):

Die Auftrennung von Proteinen erfolgte über 7,5 – 12,5 %ige SDS-Polyacrylamidgele (Laemmli 1970). Die Proben wurden zum Laden mit SDS-Probenpuffer versetzt, auf 42 °C (Membranproteine) oder auf 95 °C erhitzt und auf das Gel geladen. Die Elektrophorese erfolgte bei 150 – 200 V bis zum Auslaufen der blauen Markerbande.

Anfärben von Proteinbanden:

Die Gele wurden wie bei Sambrook (1989) beschrieben mit Coomassie Färbelösung gefärbt.

Das Entfärben erfolgte im Anschluß mit 10 %iger Essigsäure. Die entfärbten Gele wurden dann am Geltrockner getrocknet.

Westernblotanalyse:

Nach der Auftrennung der Proteine über SDS-PAGE wurden diese elektrophoretisch bei 360 mA für 30 min auf Nitrocellulose übertragen und anschließend reversibel mit Ponceaurot S-Lösung gefärbt, um die Proteinspuren und den Standard mit einem Bleistift zu markieren. Zum Blockieren der Membran wurde sie für mindestens 30 min in Blockierungspuffer geschwenkt. Anschließend wurde der primäre Antikörper in Blockierungspuffer verdünnt und auf die Membran gegeben. Die Membran wurde üN bei 4 °C mit dem primären Antikörper inkubiert. Danach wurde die Membran dreimal 10 min mit Blockierungspuffer gewaschen und dann für 1 h der sekundäre peroxidasegekoppelte Antikörper zugegeben. Die Membran wurde nochmals dreimal für 10 min in Blockierungspuffer und zuletzt 5 min mit PBS gewaschen. Die Detektion der gebundenen Peroxidase-Konjugate erfolgte durch Zugabe der Pierce Super Signal Pico Lösungen nach Vorschrift des Herstellers.

Antikörper gegen Verdünnung Bezugsquelle

c-myc 1:2000 Santa Cruz Biotechnology

(Santa Cruz, USA)

Pma1p 1:5000 (Serrano 1983)

Wbp1p 1:2000 (Knauer und Lehle 1999)

Mnn9p 1:1000 (Stolz und Munro 2002)

Vam3p 1:3000 (Laage und Ungermann 2001)

Tim23p 1:500 (Bomer et al. 1997)

Por1p 1:2000 (Söllner et al. 1989)

2.2.3.5 Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation

Die Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation wurde nach Opekarova et al. (2002) durchgeführt. Für den Dichtegradienten wurde eine 32,8 %ige Saccharoselösung in Lysis-Puffer hergestellt, je 7,5 ml in Zentrifugationsröhrchen gefüllt und üN bei -20 °C eingefroren.

Die gefrorene Lösung wurde bei 4 °C wieder üN aufgetaut, wobei sich der Gradient einstellt.

Es wurden Zellen in SD-Gal bis zu einer OD600 von 1 angezogen und die Membranen wie unter Kapitel 2.2.3.2 beschrieben isoliert. Die Proteinsuspension wurde statt in TE (Prot) in 100 µl Lysis-Puffer aufgenommen und oben auf den Gradienten geladen. Die Zentrifugation erfolgt im SW 41 Rotor bei 34000 rpm für 3 h und 4 °C. Von den Gradienten wurden 9 Fraktionen zu je 840 µl abgenommen und mit TCA gefällt. Von den Proteinen wurden je 10 µl auf SDS-Gele geladen und im Western Blot analysiert.

2.2.3.6 Indirekte Immunfluoreszenz

Es wurden 2 ml einer exponentiell wachsenden Kultur mit 0,5 ml 150 mM EGTA (pH 7,0) und 25 µl Pepstatin-Lösung (1 mg/ml) gemischt und für 5 min geschüttelt. Dann wurden 2,5 ml PARA zugegeben und für weitere 45 min geschüttelt. Weitere Zentrifugationen wurden bei 1200 rpm durchgeführt. Die Zellen wurden abzentrifugiert und zweimal mit 1 ml PEMI (PEM mit 1 µg/ ml Pepstatin) gewaschen, die Zellen anschließend für 20 bis 40 min mit der Verdau-Lösung inkubiert und währenddessen die Zellen im Mikroskop auf die Menge der Spheroplasten überprüft. Dann wurden die Spheroplasten geerntet, zweimal mit 1 ml PEMI gewaschen und in 50 µl 1 % (v/ v) Triton X-100 für 1 min inkubiert. Die Spheroplasten wurden einmal mit 1 ml PEMI gewaschen und in 50 µl PEMI mit 2 % BSA für 20 min

inkubiert. Dann wurde der primäre Antikörper (c-myc-AK 1:20) zugegeben und für 1 h inkubiert. Der Ansatz wurde dreimal mit 1 ml PEMI gewaschen, 20 µl des sekundären Antikörpers (anti-Kaninchen Tritc-Konjugat (CALBIOCHEM) 1:200 in 1 % BSA in PEMI) zugegeben und wieder für 1 h inkubiert. Die Spheroplasten wurden zweimal mit PEMI gewaschen und anschließend im Fluoreszenzmikroskop betrachtet.

2.2.3.7 Bestimmung der β-Galactosidaseaktivität

Die Bestimmung der β-Galactosidaseaktivität erfolgte nach der Methode von Miller (1972).

Die Zellen wurden üN in SD-Medium angezogen, am Morgen gewaschen, in die jeweiligen Medien, deren Einfluß auf die Expression untersucht werden sollte, auf eine OD600 von 0,2 überimpft und für 8 h bei 30 °C geschüttelt. Die Zellen wurden geerntet, zweimal mit Wasser gewaschen und auf etwa 1 OD/ ml Zellen in Z-Puffer resuspendiert. Aus dieser Suspension wurde die OD600 bestimmt und 800 µl zur Reaktion eingesetzt. Es wurden 60 µl Chloroform und 0,1 % SDS Lösung zugegeben, die Zellen für 10 sec am Vortex geschüttelt und der Ansatz für 5 min bei 30 °C vorgewärmt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 200 µl ONPG-Lösung (4 mg/ ml in Z-Puffer) gestartet und die Probe bei 30 °C inkubiert, bis die Lösung gelblich wurde. Die Reaktion wurde dann durch die Zugabe von 400 µl 1 M Na2CO3

abgestoppt und die Reaktionszeit festgehalten. Der Ansatz wurde für 10 min bei vmax

abzentrifugiert und die Absorption bei 420 nm (OD420) am Photometer bestimmt.

Die Berechnung der β-Galactosidaseaktivität erfolgte nach folgender Formel:

!

Aktivität MillerU

[ ]

^{= OD600*1000}

OD₄₂₀* Probevolumen ml

[ ]

^*Zeit

[

^min

]

Medium überimpft und für 40 min bei 30 °C inkubiert. Die Zellen wurden geerntet, in 1 ml Starvation Medium aufgenommen, 5 mM DTT zugegeben und für 8 min bei RT inkubiert.

Dann wurden 75 µl Cys/ Met ³⁵S Labeling Mix zugegeben und für weitere 12 min inkubiert.

Die Zellen wurden abzentrifugiert, mit 1 ml Chase Medium gewaschen und in 5 ml Chase Medium aufgenommen. Es wurde ein 1 ml Aliquot entnommen, die restliche Zellsuspension bei 30 °C inkubiert und nach 10, 30, 60 und 120 min weitere 1 ml Aliquots entnommen. Die Aliquots wurden sofort nach der Entnahme in flüssigem N2 eingefroren. Die Aliquots wurden dann auf Eis wieder aufgetaut, 100 µl 100 % TCA zugegeben, gemischt und für 1 h auf Eis inkubiert. Die Proben wurden abzentrifugiert, zweimal mit 1 ml kaltem Aceton gewaschen und die Pellets luftgetrocknet. Zu den trockenen Pellets wurden je 100 µl Urea-boiling-Puffer, 0,3 g Glasperlen, je 1 µl 1M PMSF Lösung zugegeben und für 30 sek bei Stufe 5 am Ribolyser geschüttelt. Die Proben wurden für 5 min auf 60 °C erwärmt, 1 ml Tween-IP-Puffer zugegeben, abzentrifugiert und 950 µl der Überstände in neue Reaktionsgefäße überführt. Es wurde 1 µl eines α-CPY-Serums (Tu et al. 2000) zugegeben und üN bei 4 °C gerollt. Zu den Proben wurden je 70 µl einer Aufschlämmung von Protein-A-Sepharose in Tween-IP-Puffer gegeben und für 3 h bei 4 °C gerollt. Die inkubierte Sepharose wurde zweimal mit je 1 ml

Tween-IP-Puffer, einmal mit 1 ml Tween-Urea-Puffer, einmal mit 1 ml SDS-Puffer und einmal mit 1ml PBS gewaschen. Dann wurden 40 µl SDS-Ladepuffer zugegeben für 3 min auf 95 °C erhitzt, 20 µl der Proteinsuspensionen auf ein 7,5 % SDS-Gel geladen und bei 150 bis 200 V elektrophoretisch getrennt. Das Gel wurde mit Coomassie-Färbelösung gefärbt, entfärbt und am Geltrockner getrocknet. Auf das getrocknete Gel wurde der Phospho–

imagerscreen bzw. ein Röntgenfilm für maximal 14 d aufgelegt.

2.2.3.9 SDH-Aktivitätstest

Die Bestimmung der Succinatdehydrogenase- (SDH) Aktivität wurde nach Robinson et al.

(1994) modifiziert. Die zum Test eingesetzten Stämme wurden in 10 ml YPD (mit 20 mg/ ml Riboflavin) üN angezogen, geerntet, mit Wasser gewaschen und auf eine OD600 von 0,2 in 250 ml YADE überimpft. Die Zellen wurden bei 30 °C bis zu einer OD600 von 0,8 inkubiert, geerntet und 2-mal mit Wasser gewaschen. 40 OD Zellen wurden mit 200 µl Homogenisierungspuffer (HP) gewaschen und erneut in 200 µl HP resuspendiert. Dann wurden Glasperlen und 1 µl PMSF zugegeben und die Zellen 2 mal 30 sec bei Stufe 5 im Ribolyser aufgeschlossen. Nach Zugabe von 1 ml HP zu den Glasperlen, wurde gevortext und die Glasperlen bei 2000 g für 3 min abzentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen, in einem SS34-Rotor-Becher gegeben in dem 6 µl PMSF vorgelegt waren, die Glasperlen nochmals mit je 1 ml HP gewaschen und der Überstand mit dem vorherigen vereinigt. Die Proteinsuspension wurde im SS34 Rotor bei 4 °C erst 10 min bei 2000 g zentrifugiert, der Überstand in einen neuen Zentrifugenbecher gegeben und 20 min bei 20000 g zentrifugiert.

Das Pellet (enthielt die Mitochondrien) wurde mit 20 ml HP gewaschen und dann für 20 min bei 20200 g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 50 µl 0,1 M Kaliumphosphat Puffer (pH 7,6) (= Mitochondriensuspension) aufgenommen und die Proteinkonzentration mittels Bradford bestimmt.

Der Enzymtest wurde in 1,5 ml Reaktionsgefäßen auf Eis pipettiert. Erst wurde 100 µl Testpuffer (TP) vorgelegt, 40 µl 0,5 % INT sowie 10 - 40 µl 1 mM Succinat (Leerprobe ohne Succinat) zugegeben und auf ein Gesamtvolumen von 180 µl mit Wasser aufgefüllt. Dann wurden 20 µl der Mitochondriensuspension (Proteingehalt 6 - 10 mg/ ml) zugegeben und für 30 min bei 37 °C unter leichtem Schütteln inkubiert. Danach wurde durch Zugabe von 200 µl 10 % TCA die Reaktion abgestoppt. Das entstandene wasserunlösliche Formazan wurde mit 900 µl Ethylacetat ausgeschüttelt und die organische Phase bei 490 nm (gegen die Leerprobe) in einer Quarzküvette am Photometer vermessen.

2.2.3.10 Prolin-Oxidase-Aktivitätstest

Der Test wurde nach Brandriss und Magasanik (1979) modifiziert. Für den Prolin-Oxidase-Aktivitätstest wurden E. coli Zellen, die das Plasmid pMALc2x-PUT1 trugen in 2TYamp

angezogen, mit 1 mM IPTG induziert, geerntet, mit Wasser gewaschen und in flüssigem N2

eingefroren. Die Zellen wurden wieder aufgetaut, in HEPES-Puffer zu 50 OD/ ml aufgenommen und mit Ultraschall aufgebrochen. Die Proteinsuspension wurde für 10 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand im Test eingesetzt. Es wurden 5 - 20 µl der Protein-lösung zu 200 µl 10 % Prolin gegeben und mit HEPES-Puffer auf 450 µl aufgefüllt. Dieser Ansatz wurde für 4 min bei 30 °C (außer beim Blindwert) inkubiert, 50 µl o-Amino-benzaldehyd-Lösung (6 mg/ ml in 20 % Ethanol) und 250 µl 10 % TCA zugegeben, geschüttelt und für 30 min bei RT inkubiert. Der Ansatz wurde 1 min bei vmax abzentrifugiert und der Überstand bei 443 nm am Photometer gegen den Blindwert vermessen.

2.2.3.11 Proteinreinigung durch Affinitätschromatographie an der Amylosesäule

Die E. coli, die das pMALc2x-Plasmid tragen, wurden in 2TYamp-Medium auf eine OD600 von 0,1 angeimpft, bei 37 °C bis zu einer OD600 von 0,5 inkubiert, dann mit 1 mM IPTG induziert und für weitere 4 h bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden geerntet, zweimal mit Wasser und einmal mit Säulenpuffer gewaschen. Das Zellpellet wurde in 15 ml Säulenpuffer aufgenommen und dreimal für 2 min bei einer Amplitude von 70 % mittels Ultraschall aufgeschlossen. Das Lysat wurde bei 4 °C für 5 min im SS34-Rotor bei 40000 g zentrifugiert, der Überstand zu ca. 1 ml Amylosesäulenmaterial gegeben, das vorher mit Säulenpuffer äquilibriert wurde, und für 2 h bei 4 °C gerollt. Anschließend wurde die Suspension in eine 15 ml Säulenkartusche gegeben und der Durchlauf aufgehoben. Die Säule wurde sechsmal mit 1,5 ml Säulenpuffer gewaschen (W1-W6) und das mit dem MBP fusionierte Protein in 6 Aliquots zu je 1,5 ml mit Elutionspuffer eluiert. Je 10 µl der Aliquots wurden auf einem 10 %igem SDS-Gel analysiert. Die Quantifizierung des Proteins erfolgte im SDS-Gel durch einen Vergleich mit BSA bestimmter Konzentrationen.

Im Dokument Untersuchungen zur Wahrnehmung und zur Aufnahme von Riboflavin in Saccharomyces cerevisiae (Seite 52-57)