Realtime PCR Quantifizierung der Infektion mit S. sclerotiorum

Zur Einschätzung der Resistenz wurde im Pflanzenmaterial die DNA-Menge von S. sclerotiorum durch eine quantitative Realtime Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) bestimmt.

Isolierung von DNA

Die Extraktion der genomischen DNA aus Proben des Resistenzscreenings erfolgte über die modifizierte Methode zur RNA- und DNA-Isolation nach Winter et al. (2013). Für die Extraktion wurden 100 mg des gemahlenen Stängelmaterials in ein vorgekühltes 2 ml Reaktionsgefäß abgewogen und mit 500 µl 80°C heißem RNA-/DNA-Extraktionspuffer versetzt. Die Probe wurde rasch gevortext und 500 µl Phenol hinzugegeben. Nach kurzer Durchmischung und einem Zentrifugationschritt bei 16.060 x g und 4°C für 10 min (Heraeus^® Biofuge^® fresco, Fa. Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham/Massachusetts, USA) wurde der wässrige Überstand (ca. 350 µl) in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß überführt. Dieser wurde nun mit 500 µl Chloroform-Isoamylalkohol (Verhältnis 24:1) versetzt, invertiert und erneut auf höchster Stufe bei 4°C für 5 min zentrifugiert. Von der oberen wässrigen Phase wurden 300 µl in ein frisches 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt, 1 Volumen 4 M LiCl hinzugegeben und die Proben für drei Stunden auf Eis inkubiert.

Dieser Schritt dient der Fällung der RNA. Anschließend wurde die Probe bei 16.060 x g bei 4°C für 20 min zentrifugiert und der erhaltene Überstand in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen gegeben. Mit dem erhaltenen RNA-Pellet wurde dann entsprechend der Angaben zur RNA-Isolierung weiterverfahren. Durch die Zugabe von 0,75 Volumen

7,5 M NH4-Acetat und 2,5 Volumen Ethanol (96%) wurde DNA gefällt. Nachdem die Proben für eine Stunde bei -20°C inkubiert wurden, erfolgte die Zentrifugation bei 4.227 x g und 4°C (Model 4K 10, Fa. Sigma Laborzentrifugen GmbH, Osterode am Harz, Deutschland) für 20 min zur Pelletierung der DNA. Bis auf 1 ml wurde der gesamte Überstand verworfen und das Pellet darin resuspendiert. Die Probe wurde dann in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt, nochmals zentrifugiert (16.060 x g, 4°C, 15 min) und der Überstand verworfen. Das erhaltene Pellet wurde in 700 µl eisgekühltem Ethanol gewaschen und für 5 min zentrifugiert. Der Ethanolüberstand wurde verworfen und das DNA-Pellet bei 240 x g in der Vakuumzentrifuge (Concentrator 5301, Fa. Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland) bei 30°C für 10 min getrocknet. Anschließend wurde die DNA in 200 µl 1 x TE Puffer für ca. eine Stunde oder über Nacht bei RT gelöst. Die Überprüfung der Qualität und Konzentration der gewonnen DNA erfolgte über Gelelektrophorese.

Hierfür wurden 5 µl DNA mit 0,2 Volumen 6 x Loading Dye (Fa. Thermo Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, USA) beschwert und auf ein 1% (w/v) Agarosegel, hergestellt mit 0,5 x TBE Puffer, aufgetragen. Die Elektrophorese lief bei 3 V/cm Gel in 0,5 x TBE Puffer ab und wurde über Ethidiumbromidfärbung visualisiert. Die Dokumentation erfolgte auf dem Transilluminator unter UV-Licht mittels Rotfilter (Geldoc 1000, Fa. Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, USA). Für die Auswertung der Proben wurde die Quantity One® Software (Version 4.5.0, Bio-Rad) verwendet. Zur densitometrischen Bestimmung der DNA-Konzentration, wurde eine Standardreihe aus Lambda-DNA (Fa. Thermo Scientific Inc., Waltham, Massachusetts, USA) erstellt und die Proben mit Hilfe der Software Multi-Analysist (Version 1.1, Fa. Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, USA) analysiert.

Preparation der S. sclerotiorum-Standard-DNA für die qPCR

Genomische DNA von S. sclerotiorum wurde aus dem Isolat Ss1.5 isoliert, welches in flüssigem halbkonzentriertem PDB-Medium entsprechend dem Protokoll aus Abschnitt 2.3 angezogen wurde. Das erhaltene Myzel wurde abgenutscht und gefriergetrocknet und anschließend in flüssigem Stickstoff gemahlen. Anschließend erfolgte die Extraktion aus 50 mg Pilzmyzel nach dem modifizierten Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) DNA-Extraktionsprotokoll von Brandfaß & Karlovsky (2008). Die Konzentration und Qualität der erhaltenen Pathogen-DNA wurde wie oben beschrieben quantifiziert und eine Verdünnungsreihe von 1 ng bis hin zu 0,1 pg mit einem Verdünnungsfaktor von 10 in 1 x TE Puffer angesetzt.

Quantitative Realtime PCR

Für diesen Prozess wurde ein hoch spezifisches Primerpaar verwendet, welches für die Identifizierung von S. sclerotiorum entwickelt wurde (Tab.8, Yin et al., 2009).

Tab. 8 Angabe des für die qPCR verwendeten spezifischen S. sclerotiorum Primerpaares mit zugehöriger Basensequenz und der Herkunft

Für die Quantifizierung der Biomasse von S. sclerotiorum wurde das 2 x SensiFast^TM Probe No-ROX Kit (Bioline GmbH, Luckenwalde, Deutschland) verwendet. Die DNA-Extrakte der Stängelproben wurden entsprechend ihrer Konzentrationen verdünnt, so dass immer 1 µg DNA-Template in der qPCR eingesetzt wurde. Des Weiteren enthielt jede Reaktion 5 µl 2 x SensiFast Mix (3 mM Magnesium je Reaktion), je 0,4 µM des Vorwärsts- und Rückwärts-Primers und bidest. Wasser, wodurch der Ansatz auf ein Gesamtvolumen von 10 µl aufgefüllt wurde. Die Amplifikation und Schmelzkurvenanalyse erfolgte im Thermozykler CFX384 Realtime PCR Detektionssystem von Rad (Fa. Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, USA) in 384er Platten (Quali Microtest Plates, Fa. Kisker Biotech GmbH & Co. KG, Steinfurt, Deutschland) unter Verwendung des in Tabelle 9 gelisteten Programms.

Tab.9 Ablauf der qPCR-Reaktion

Abschnitt Schritt Phase Zeit Temperatur [°C]

Amplifikation

S. sclerotiorum SsF Vorwärts AGTCGAGGGACGGGTACTAA

Yin et al., 2009 SsR Rückwärts CTTGTCCTCCATTGCCGTTT

Während der Amplifikation wurde nach jedem Elongationsschritt (Schritt 4) sowie während der Schmelzkurvenanalyse, alle 5 Sekunden nach jedem Temperaturanstieg um 0,5°C, das Fluoreszenzsignal durch den Fluoreszenzdetektor gemessen. Die Filtereinstellung für die Anregung und Emission des SYBR Green Fluoreszenzfarbstoffes lagen bei 490 nm und 530 nm. Zur Datenauswertung wurde die CFX Manager Software (Fa. Bio-Rad Laboratory Inc., Hercules, USA) verwendet. Je DNA-Stängelproben wurden immer drei technische Wiederholungen durchgeführt.

Die ermittelten DNA-Mengen von S. sclerotiorum in Pikogramm pro Milligramm eingesetzter Frischmasse berechneten sich entsprechend der angegebenen Formel.

Ss‒DNA pg

mg FM = Ss‒DNA pg / Vol. qPCR [µl]

FM (DNA−Extraktion) mg ∗ Volm. DNA−Extrakt [µl]

Bei der Verrechnung der Sclerotinia-DNA-Menge wurden Verdünnungseffekte, wie das Volumen, welches in die qPCR eingesetzt wurde, die Menge Frischmasse, aus der die DNA extrahiert wurde, sowie das Volumen 1 x TE Puffer, in dem das extrahierte DNA-Pellet gelöst wurde, berücksichtigt.

Um die beiden Versuchsdurchgänge miteinander zu vergleichen, wurde die relative Sclerotinia-DNA-Menge (rel. Ss-DNA) in Prozent nach folgender Formel ermittelt.

rel. Ss‒DNA [%] = (Ss‒DNA X ∗100) Ss‒DNA (LSs, 7dpi)

Hierbei ergab sich die relative Ss-DNA (rel. Ss-DNA), indem die Ss-DNA-Gehalte jeder Brassica-Art, Behandlung und Zeitpunkt (Ss-DNA (X)) durch den Mittelwert der Menge an Ss-DNA der Sclerotinia-inokulierten Behandlung des anfälligen Genotyps Loras zum Zeitpunkt 7 dpi (Ss-DNA (LSs, 7dpi)) geteilt wurde.

2.6.5.3 Expression von Genen des Phenylpropanoidsyntheseweges