In vivo Blattsegmenttest von Brassica-Arten zur Oxalsäuresensitivität

Über die Zeitperiode von 2012 bis 2013 wurde das Screening zweimal wiederholt, wobei sich die Genotypensets zwischen den Versuchsjahren teilweise unterschieden. Insgesamt wurden 12 Pflanzen je Art im Screening getestet.

2.5.1 Pflanzenmaterial und –anzucht

Im Blattsegmenttest wurden die gleichen Brassica-Arten untersucht, wie bereits im Gewächshausscreening (siehe Abschnitt 2.4.1). Die Aussaat erfolgte, wie im vorangegangen Abschnitt 2.4.2 beschrieben, in Pikierschalen mit einem 3:1 Substratgemisch. Die angewachsenen Keimlinge wurden ebenfalls in Multitopfplatten pikiert, jedoch nicht vernalisiert oder umgetopft. In diesem Zustand wurden die Pflanzen in einem geschlossenen Klimaraum bei einer konstanten Temperatur von 20 ± 2°C und konstanter Luftfeuchte (ca. 20%) kultiviert. Die tägliche Photoperiode betrug 16 Stunden bei einer Beleuchtungsstärke von 155 µmol/m²/s im Abstand von ca. 1,5 m durch den Lampentyp Phillips SON-T PIA Argo 400 W (Fa. Phillips GmbH Market DACH, Hamburg, Deutschland). Da es sich um einen geschlossenen Raum handelte, muss berücksichtigt werden, dass keine natürlich einfallende Strahlung vorhanden war. Die Bewässerung der Pflanzen erfolgte von unten über ein Gießflies, um Trockenstress zu vermeiden. Unter diesen standardisierten Bedingungen wurden die Pflanzen ungefähr fünf Wochen angezogen, bis das fünfte Laubblatt (BBCH-Stadium 15) voll entwickelt war. Am Tag vor der Durchführung des in vivo Screenings wurden die Pflanzen ausreichend gewässert, um sicherzustellen, dass die Wasserversorgung zum Zeitpunkt des Tests zwischen den Pflanzen identisch war. Während der Anzucht wurden die Pflanzen nicht gedüngt und vollständig auf Pflanzenschutzmaßnahmen verzichtet, um eventuelle Beeinflussungen der Messergebnisse durch Spritzrückstände auf den Blättern zu vermeiden. Pflanzen die von Schädlingen oder Pathogenen befallen waren, wurden nicht für den Test verwendet.

2.5.2 Blattsegmenttest modifiziert nach Wulf (2011)

Zur Vorbereitung wurde am Vortag des Screenings eine 2 mM Oxalsäurelösung mit bidestilliertem (bidest.) Wasser angesetzt. Des Weiteren wurden 24er Zellkultur-Mikrotiterplatten (Fa. Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland) gründlich mit bidest. Wasser gespült und anschließend die Leitfähigkeit mittels eines Leitfähigkeitsmessers des Typs CDM 2e (Fa. Radiometer Kopenhagen, Dänemark) überprüft. Dafür wurde die Vertiefung mit bidest. Wasser aufgefüllt, welches dann in die Elektrode des Leitfähigkeitsmessgerätes eingesaugt wurde. Hohe Leitfähigkeiten deuteten auf Verunreinigungen hin, so dass die Platte erneut mit bidest. Wasser gespült

wurde. Saubere Platten konnten über Nacht getrocknet werden. Direkt vor der Durchführung des Blattsegmenttests wurden alle Geräte und Gefäße gründlich mit bidest.

Wasser gespült. Für den eigentlichen Test wurde von 12 gleich entwickelten Pflanzen jeder Art das fünfte Laubblatt entnommen. Aus jedem Laubblatt wurde rechts und links der Mittelrippe eine Blattscheibe von 10 mm Durchmesser mit einem Korkbohrer ausgestochen. Dabei wurde darauf geachtet, dass die Blätter keine Risse oder sonstige Verletzungen aufwiesen und die Blattscheiben immer mittig ausgestochen wurden. Diese Blattscheibenpaare wurden dann geordnet mit der Blattunterseite in die Vertiefungen der Mikrotiterplatten gelegt und je eine Hälfte mit 2 ml bidest. Wasser und die andere Hälfte mit 2 ml 2 mM Oxalsäurelösung entsprechend der Abbildung 2 befüllt. Um einen gleichmäßigen Kontakt mit den Lösungen sicherzustellen, wurden entstandene Luftblasen unter den Blattscheiben entfernt. Anschließend wurden die Platten mit Parafilm verschlossen und in einem Mytron Klimaschrank (WB 750 KFL) bei konstanten 20°C unter Kunstlichtbeleuchtung durch den Lampentyp Osram Natura T8 (L 18 W/76, Beleuchtungsstärke: 37 µmol/m²/s in 34 cm Abstand, Fa. Osram GmbH, München, Deutschland) inkubiert. Nach zwei Stunden wurde das bidest. Wasser sowie die Oxalsäurelösung vollständig aus den Mikrotiterplatten entfernt und jede Vertiefung mit der darin befindlichen Blattscheibe zweimal mit bidest. Wasser gespült. Dies sollte sicherstellen, dass jegliche Rückstände der Oxalsäurelösung entfernt wurden. Nach dem Spülen wurden die Wells erneut mit je 2 ml bidest. Wasser befüllt. Hierbei wurde wiederum darauf geachtet, dass sich keine Luftblasen zwischen Blattscheibe und Lösung bildeten sowie stets die Blattunterseite auf der Lösung auflag. Anschließend erfolgte die Bestimmung der Leitfähigkeit in Mikrosiemens (µS) durch Einsaugen des bidest. Wassers in die Elektrode des Leitfähigkeitsmessgeräts. Nach dem Ablesen des Wertes wurde das Wasser wieder zurück in die Vertiefung gegeben (Abb. 3). Wells, bei denen die erste Messung einen Wert von 3,5 µS überschritt, wurden erneut mit bidest. Wasser gespült.

Nach der Rückgabe des Wassers aus der Elektrode wurden Luftblasen wiederum entfernt und die Platten erneut in den Klimaschrank bei 20°C und künstlicher Beleuchtung gestellt.

Die Messung der Leitfähigkeit erfolgte von diesem Zeitpunkt an nach 1, 2, 3 sowie 24 Stunden. Dabei wurde das bidest. Wasser jedesmal wieder zurück in die Vertiefung gegeben, um es zum nächsten Zeitpunkt erneut messen zu können. Die Messungen nach 1, 2 und 3 Stunden dienten dabei lediglich als interne Kontrolle, um Oxalsäurerückstände in den Vertiefungen oder Verletzungen der Blattscheiben frühzeitig zu erkennen und entsprechende Blattscheiben nicht in die Versuchsauswertung mit einzubeziehen. Die gemessenen Leitfähigkeiten der Oxalsäurevariante (2 mM OA) zu Beginn des Testes (0 h) sowie 24 Stunden nach Oxalsäureinkubation (24 h) wurden entsprechend um die

jeweiligen Leitfähigkeiten der Wasserkontrollvariante korrigiert und die Endleitfähigkeit ∆S nach der unten beschriebenen Formel berechnet.

∆S = (S2 mM OA ;24h−xS2 mM OA ;0h)−(xSWasser ;24h −xS_{Wasser ;0h})

Wobei S2 mM OA ;24h der Wert der Leitfähigkeit zum Zeitpunkt 24 Stunden nach der Inkubation mit 2 mM Oxalsäure und xS2 mM OA ;0h der Mittelwert der Leitfähigkeiten nach Oxalsäureinkubation zum Zeitpunkt 0 Stunden, unmittelbar nach dem Spülen mit bidest.

Wasser ist. xS_{Wasser ;0h} und xSWasser ;24h sind die äquivalenten Leitfähigkeiten in der Wasserkontrolle zu den Zeitpunkten 0 und 24 Stunden nach Inkubation.

Um auch hier natürliche Variationen zwischen den verschiedenen Versuchsjahren zu kompensieren, wurde eine Normalisierung der Änderung der Leitfähigkeit jeder Akzession zur Basis der Reaktion der Referenzkontrollen vorgenommen.

norm. ∆S= ∆S(X)

[ ∆S Zhongshuang 9 + ∆S Pacific /2]

Während des gesamten Ablaufs des Blattsegmenttests wurde mit Sorgfalt darauf geachtet, die Blattscheiben weder beim Befüllen, noch beim Absaugen der Lösungen oder Entfernen der Luftblasen zu verletzten, um einer Verfälschung der Ergebnisse vorzubeugen. Um Verunreinigungen durch herabfallende Staubteilchen zu vermeiden, wurde während des gesamten Versuchablaufs unter dem Abzug gearbeitet.

Abb. 2 Inkubationsschema der Blattscheiben in einer 24er Mikrotiterplatte mit bidest. Wasser und 2 mM Oxalsäurelösung.

bidest. Wasser

2 mM Oxalsäurelösung

Abb. 3 Bestimmung der Leitfähigkeit nach Inkubation der Blattscheiben mit Oxalsäure durch Einsaugen des bidest. Wassers in die Messelektrode des Leitfähigkeitsmessgerätes.

2.5.3 Bestimmung der Anzahl der Spaltöffnungen

Da das untersuchte Material eine hohe Variabilität aufwies, wurde die Anzahl der Spaltöffnungen pro mm² Blattfläche bestimmt. Zur Auszählung wurden Negative der Blattunterseiten angefertigt. Dafür wurden die Blätter mit Nagellack bepinselt und dieser nach Trocknung mittels Tesafilm auf einem Objektträger fixiert. Unter dem Mikroskop wurden anschließend die Stomata für je 5 Teilflächen von je 0,069 mm² Größe bei 400-facher Vergrößerung ausgezählt und daraus die Anzahl pro 1 mm² Blattfläche berrechnet. Je Genotyp wurden immer sechs Blätter untersucht.