Ziel dieser Arbeit war es neue Synthesewege zu den Tetramsäuren Caldoramid (4), JBIR-141 (5) und JBIR-142 (6) aufgrund ihrer vielversprechenden Bioaktivitäten zu erarbeiten[46,69]. Diese stellen bedingt durch ihre hohe Dichte an unterschiedlichen funktionellen Gruppen, wie im Fall von 5 und 6, oder durch ihre hohe Anzahl an N-methylierten Peptidbindungen im Fall von 4 synthetisch anspruchsvolle Naturstoffe dar. Der Naturstoff Caldoramid (4) ist ein Vertreter der Klasse der peptidischen 3O-Methyltetramate und strukturell verwandt mit den Naturstoffen Belamid (52) oder Dolastatin 15 (55), wobei vor allem zu letzterem verschiedene Synthesewege in der Literatur beschrieben sind, die auf der Verknüpfung einzeln aufgebauter Fragmente basieren.[72,73] Im Unterschied dazu wurde in dieser Arbeit eine Strategie erarbeitet, bei der ähnlich einer Festphasenpeptidsynthese der Aufbau des Gesamtsystems direkt am Kern, dem 3O-Methyltetramat, hin zur N-terminalen N,N-Dimethylalanin-Aminosäure stattfinden sollte.
Abbildung 63: Struktur der Zielverbindungen Caldoramid (4), JBIR-141 (5) und JBIR-142 (6) und strukturverwandte Naturstoffe Belamid A (52) und Dolastatin 15 (55) sowie Alanosin (72).
anderem bei der Regulation der Zellproliferation, -apoptose, -metabolismus, im Stressmanagement und der Lebensdauer beteiligt[70,71]. Störungen von FoxO3a stehen in direktem Zusammenhang mit Krebs, Fibrose und altersbedingten Krankheiten, wodurch die Optimierung der FoxO3a-Aktivität in der Behandlung dieser Krankheiten zielführend sein kann[69,71]. Strukturell gesehen, enthalten die Naturstoffe JBIR-141/142 (5/6) neben der Tetramsäure- sowie der Oxazolin-Einheit eine N-Nitroso hydroxyaminofunktion, welche bis dato nur in Totalsynthesen strukturell einfacherer Verwandter wie dem Alanosin (72) hergestellt worden ist[55]. Eine Synthesestrategie zum Aufbau und zur Verknüpfung der Funktionalitäten in den Naturstoffen 5 und 6 sollte hier erarbeitet werden und den Grundstein für eine spätere Totalsynthese legen.
Zur Synthese von Caldoramid (4) wurde ausgehend vom L-Phenylalanin 96 der Methylester 97 hergestellt und anschließend nach einer Methode von SCHOBERT[74] mit Ketenylidentriphenylphosphoran zum Tetramat 98 umgesetzt (Abbildung 64). Daneben wurde Boc-Isoleucin 102 mit CH3I zu 103 N-methyliert und nach verschiedenen Versuchen der Aktivierung als Acyl-Imidazol 104 mit dem deprotonierten Tetramat zu 105 umgesetzt.
Abbildung 64: Synthese der Dolapyrrolidon-Einheit 98 und des Kopplungsproduktes 105, Reagenzien und Bedingungen: a) i) SOCl2, CH3OH, ii) NaHCO3(aq), b) Ph3PCCO, Toluol, rf, 59%
über zwei Stufen, c) CH3I, NaH, THF, 90%, d) Im2CO, THF, 0 °C, 78%, e) i) 98, LiHMDS, THF,
―40 °C, ii) 104, 55%.
Anschließend wurde Verbindung 105 sauer entschützt. Eine Kupplung der nächsten Aminosäure konnte in Form von Fmoc- oder Boc-N-Methyl-Valin mittels verschiedener Aktivierungsreagenzien nicht erreicht werden, was eine Änderung der Schutzgruppenstrategie auf die nosylierte Aminosäure 110 erforderlich machte (Abbildung 65). Nach Aktivierung als Säurechlorid mit Ghosez Reagenz, 1-Chloro-(N,N,2-trimethyl)-1-propenylamin, und Kopplung mit dem Baustein 106 wurde das Peptid 111 erhalten, welches nachfolgend selektiv am N-Terminus in quantitativer Ausbeute methyliert wurde.
Verbindung 113 konnte unter Verwendung des geruchsarmen Thiophenols 116 Nosyl-entschützt und die nächste Nosyl-Valin-Aminosäure wiederum gekuppelt und entschützt werden. Die letzte Aminosäure, das Dimethylvalin 115, wurde in einer Eschenweiler-Clark-artigen Reaktion[86] hergestellt und in einem finalen Kopplungsschritt an die entschützte Verbindung 114 geknüpft. Die Zielverbindung 4 konnte in 12 Schritten (längste lineare Kette) mit einer insgesamten Ausbeute von 16% erhalten werden. Ein Vergleich mit den Literaturdaten des Isolates zeigte neben der leichten Abweichung der NMR-Signale zu höheren ppm keine Übereinstimmung der Drehwerte ([α]20D― 13.2 (c = 0.50, CH3OH), Lit: [α]25D +11.1 (c = 0.36, CH3OH)). Ein eindeutige Bestimmung sollte mit einem direkten Vergleich mit einer Probe des natürlichen Isolats z.B. mittels NMR, CD/ORD oder HPLC durchgeführt werden.[91]
Verbindung 4 zeigte in MTT-Assays an menschlichen Dickdarmkarzinomzelllinien HT-29 und HCT-116wt IC50-Werte von 77.5 ± 1.3 µM und 43.8 ± 3.7 µM. An der Brustkrebszelllinie MCF-7 wurde ein IC50-Wert von 33.9 ± 1.3 µM ermittelt.[92]
Abbildung 65: Synthese des Kopplungsproduktes 111 und Methylierung der nosylierten Verbindung 113, Reagenzien und Bedingungen: a) TFA, CH2Cl2, 94%, b) pNos-Cl, 1 M NaOH, 0 °C, 71%, c) i) 110, 1-Chloro-(N,N,2-trimethyl)-1-propenylamin,
CH2Cl2, ii) 106, NaHCO3, 78%, d) CH3I, K2CO3, DMF, 99%.
Das zweite Ziel dieser Arbeit, die Erabeitung der Grundlagen eines synthetischen Zugangs zu den Naturstoffen JBIR-141 (5) und JBIR-142 (6), sollte in Form von Testsystemen, die die Verknüpfung der N-Nitroso hydroxyamino-, Oxazolin- und Tetramsäure-Einheit ermöglichen, erfolgen. Zur Synthese der Oxazolin-Einheit wurde zunächst L-allo-Threonin allo-146 ausgehend von L-Threonin 146 nach literaturbekannter Vorschrift hergestellt. Dies war nötig, da die meisten Oxazolin-Ringschlussmethoden unter Inversion des Stereozentrums am β-Kohlenstoff erfolgen. Verbindung allo-146 wurde anschließend methyliert und mit Dimethyl-L-alanin 155 in einer EDCI-Kupplung zum Dipeptid 160 umgesetzt. Die Aminosäure Alanin wurde zuvor wiederum unter Eschenweiler-Clark-artigen Bedingungen zu 155 in 98%iger Ausbeute umgesetzt. Eine Umsetzung zum trans-Oxazolin 161 erfolgte am Dipeptid 160, wobei der Einsatz des benzylgeschützten Dipeptids zu Eliminierung geführt hatte (Abbildung 67).
Abbildung 66: Synthese von Caldoramid (4), Reagenzien und Bedingungen: a) 116, K2CO3, DMF, b) i) 110, 1-Chloro-(N,N,2-trimethyl)-1-propenylamin, CH2Cl2, ii) NaHCO3, 85% über zwei Stufen, c) 116, K2CO3, DMF, d) N,N-Dimethyl-L-Valin, HATU, DIPEA, 64% über zwei
Stufen, e) CH2O(aq), H2O, Pd/C (10%), 99%.
Die Synthese der 3-Acyltetramsäure sollte via Dieckmann-Cyclisierung[127] des entsprechenden β-Ketosystems 119 hergestellt werden. Dazu wurde Boc-L-Alanin (167) in das Oxazolidinon 168 überführt, zur N-Methyl-Aminosäure 169 reduziert und der Ethylester 170 erzeugt.
Abbildung 67: Synthese des Oxazolin-Bausteins 161, Reagenzien und Bedingungen: a) CH3OH, SOCl2, 0 °C → rf, 98%, b) AcCl, NEt3, CH2Cl2, 94%, c) SOCl2, RT, d) 10% HCl (aq), rf, e) SOCl2, CH3OH, 90% über drei Stufen (c-e), f) 155, EDCI, HOBt, DIPEA, CH2Cl2, 54%, g) PPh3, DIAD, THF, 0 °C, 45%,
h) CH2O (aq), Pd/C (10%), H2, H2O, 98%.
Abbildung 68: Synthese des β-Ketosystems 119, Reagenzien und Bedingungen: a) CH2O, pTsOH, Benzol, 77%, b) Et3SiH, TFA, CH2Cl2, 99%, c) SOCl2, EtOH, 85%, d) EtOH, H2SO4, 81%, e) NaH, BnBr,
TBAI, THF, 80%, f) KOH, H2O, EtOH, 89%, g) Meldrumsäure, DMAP, CH2Cl2, 85%, h) Ethyl N-methyl L-alaninat (170), NEt3, Toluol, rf, 41%, i) H2, Pd/C, CH3OH, 80%.
Benzylschutzgruppe hydrogenolytisch zu 119 abgespalten werden.
Mit den Fragmenten 161 und 119 in der Hand, wurde nachfolgend ein vereinfachter Baustein für ein Testsystem mit N-Nitroso hydroxyamino-Funktion aufgebaut (Abbildung 69).
Abbildung 69: Synthese eines vereinfachten Bausteins mit N-Nitroso hydroxylamino-Funktion, Reagenzien und Bedingungen: a) TMSCl, CH3OH, 99%, b) Boc2O, NEt3, H2O/1,3-Dioxan, 90%, c) tBuOH, Boc2O, DMAP, 66%, d) Boc2O, DMAP, MeCN, 80%, e) DIBAL-H, Et2O, f) BnO-NH2 x HCl, Pyridin, EtOH, 67% über 2 Stufen, g) NaBH3CN, pH 2-3, CH3OH, 90%, h) BuONO, CH2Cl2, 82%, i) TFA, CH2Cl2, 0 °C oder pTsOH x H2O, MeCN, 0 °C, j) Pd/C (5%), H2,
0.5 M NaOH/CH3OH, k) BnBr, NEt3, EtOAc, 69% über zwei Stufen.
Dazu wurde L-Glutaminsäure 186 an der Seitenkette selektiv Methyl-verestert (187) und über Einführung von Boc- und tBu-Schutzgruppen in drei Stufen in Verbindung 191 überführt. Es folgte eine Reduktion der Seitenkette zum Aldehyd 192, Umsetzung mit Benzylhydroxylamin Hydrochlorid zur Schiffschen Base 193 und wiederum Reduktion zu 194. Das Hydroxylamin wurde mit Butylnitrit in Verbindung 195 überführt und konnte unter Ausschluss von Licht auch über einen längeren Zeitraum ohne erkennbare Zersetzung kühl gelagert werden. Jedoch schlugen verschiedene Versuche, sowohl aus dem Di-Boc-Amin 195, als auch aus dem Mono-Boc-Amin 197 mittels saurer Entschützung das Amin freizusetzen und Verbindung 196 zu erhalten, fehl, da sich das N-Nitroso Benzylhydroxylamin 195 unter Einwirkung von Säuren zersetzte. Die Abnahme der Benzylschutzgruppe setzte die tautomere Verbindung 199 frei, die hauptsächlich in Form des Diimid-N-Oxids 199b vorlag. Diese konnte bei erneuter Umsetzung mit Benzylbromid als Verbindung 200 abgefangen werden, die im Gegensatz zu 195 mit pTsOH Boc-entschützt werden konnte. Mit Verbindung 201 in der Hand konnte eine Kupplung mit dem in situ hergestellten Cäsium-Salz des Oxazolins 202 erzielt werden (Abbildung 70).
Über die Schützung der N2O2-Funktion als benzyliertes Diimid-N-Oxid war dieses stabil genug, um sauer abspaltbare Schutzgruppen zu entfernen und unter Peptidkupplungsbedingungen Fragemente zusammen zu fügen.
Weitere Syntheseschritte die zum Aufbau der Naturstoffe JBIR-141 (5) und -142 (6) erforderlich sind, sind die Entschützung des C-Terminus, Veresterung mit dem β-Ketosystem 119, TBAF-vermittelte Cyclisierung zur 3-Acyltetramsäure und Benzylentschützung zu den Zielverbindungen (Abbildung 71).
Eine saure tBu-Entschützung (TFA in CH2Cl2)[137] ist nach LEY et al.[138] auch in Gegenwart des Oxazolin-Systems literaturbekannt und könnte auch für Verbindung 124 erfolgreich sein. Die nachfolgende
Abbildung 70: Kupplungsprodukt aus Oxazolin- und N-Nitroso hydroxyamino-Baustein, Reagenzien und Bedingungen: a) pTsOH x H2O, MeCN, b) CsOH x H2O, c) EDCI, HOBt, DIPEA, CH2Cl2, 45%.
Neben diesen Untersuchungen zum Aufbau von 5 und 6 wurden in dieser Arbeit auch erste Versuche zur Synthese des Bausteins 118 unternommen und zwei Methoden hinsichtlich ihre Praktikabilität untersucht. Die erste Methode bediente sich der Reformatsky-Reaktion und begann mit der Benzylschützung von L-Glutaminsäure zu 220 und anschließender Reduktion der Seitenkette zum Alkohol 221. Nach TIPS-Schützung wurde über zwei Stufen der Aldehyd 224 erzeugt. Das Reagenz 226 wurde mit Zn in situ zum Reformatsky-Reagenz[146] umgesetzt und reagierte mit 224 zu dem Diastereomerengemisch 225. Eine Bestimmung der relativen Konfiguration des Hauptdiastereomers konnte indirekt anhand von NOESY-Messungen durchgeführt werden und deutete darauf, dass die gewünschte (3R,4S)-Verbindung in einem marginalen Überschuss von 7% erzeugt wurde. Eine weitere Untersuchung der Route wurde nicht durchgeführt, da im Zuge dieser Arbeit zum einen keine geeignete Auftrennungsmethode der Diastereomere gefunden werden konnte, zum anderen war auch die Schutzgruppenstrategie und Entschützung derselben problematisch.
Abbildung 71: Plan zur formalen Synthese der Naturstoffe JBIR-141 (5) und JBIR-142 (6), Reagenzien und Bedingungen: a) TFA, CH2Cl2, b) 119, EDCI, DIPEA, THF, c) TBAF, THF, d) H2, Pd/C, EtOAc.
Die zweite Methode zum Aufbau des Bausteins 118 verwendete als Schlüsselschritt eine Grignard-Reaktion mit (R)-Pantolacton 235 als Ausgangsstoff. Die Stereoinduktion sollte zum einen vom (R)-konfiguierten Stereozentrum, zum anderen aber über die dort eingeführte Schutzgruppe erfolgen. Das Edukt (R)-235 wurde in zwei Stufen in das MEM-geschützte Lactol 266 überführt. Dieses reagierte mit Allylmagnesiumchlorid unter Ringöffnung zu dem Diastereomerengemisch 267a und 267b. Bei der Wahl des Lösungsmittels hatte sich trockenes CH2Cl2 als vorteilhaft erwiesen. Dieses ermöglichte eine Chelatisierung zwischen dem Grignard-Reagenz und der MEM-Gruppe, sodass ein leichter Überschuss des gewünschten Diastereomers 267a erhalten wurde. Die Durchführung in Ether-Lösungsmitteln wie THF oder Et2O hingegen unterband diese Wechselwirkungen und lieferte ein 1:1 Produktgemisch. Eine Trennung der beiden Verbindungen war auf dieser Stufe via Säulenchromatographie möglich und entschädigte die mäßige Stereoinduktion der Additionsreaktion. Im Rahmen dieser Arbeit konnten desweiteren die Überführung des Alkohols 269 in das Boc-geschützte Amin 272 über zwei Stufen und die TBS-Entschützung zu Verbindung 273 durchgeführt werden.
Abbildung 72: Erste Versuche zur Synthese des Bausteins 118 via Reformatsky-Reaktion, Reagenzien und Bedingungen: a) BnBr, K2CO3, NaOH, H2O, rf, 56%, b) DIBAL-H, THF, ―10 °C, 71%, c) TIPSCl, Imidazol, DMF, 90%, d) LiAlH4, THF, 0 °C, 90%, e) (COCl)2, NEt3, CH2Cl2, 94%, f) i) 226, Zn,
LiBr, BrCH2CH2Br, Et2O, ii) 224, Et2O, ―10 °C, 25%.
Im Vergleich zur Reformatsky-Route sind für den Aufbau von 118 mehr Reaktionsschritte erforderlich, jedoch ermöglicht die Einführung der terminalen Doppelbindung auf später Stufe eine Divergenz zu den beiden Seitenketten von JBIR-141 (5) und JBIR-142 (6) (Abbildung 74). Nachfolgend könnte durch Oxidation des Alkohols 273 zur Carbonsäure (z.B. nach Lit[165]) und anschließende Veresterung (vgl.
Lit[166]) die zentrale Verbindung 274 hergestellt werden. Mit dieser könnten mittels Hydroborierung (c, Lit[154]) oder asymmetrischer Sharpless-Hydroxylierung (d, Lit[155]) die Verbindungen 275 bzw. 276 erhalten werden. Eine Überführung von 275 in vier Stufen (Lit[168,68]) zu der Hydroxy-Nitrosoamino-Verbindung 278 und die anschließenden Schutzgruppentransformationen i - k (Lit[169][170]) sollten die Schlüsselverbindung 280 liefern. Analog dazu soll der primäre Alkohol in Verbindung 276 selektiv zum Aldehyd oxidiert (vgl. Lit[166]) und der sekundäre Alkohol Benzylgeschützt werden. Ebenso sollen die Reaktionsschritte f - k zur zweiten Schlüsselverbindung 285 führen. Nach Boc-Entschützung der Schlüsselverbindungen können diese jeweils wie in Abbildung 71 dargestellt zu den Naturstoffen 5 bzw.
6 umgesetzt werden.
Abbildung 73: Erste Versuche zur Synthese des Bausteins 118 via Grignard-Reaktion, Reagenzien und Bedingungen: a) MEMCl, NaH, THF, 70%, b) DIBAL-H, THF, 91%, c) Allylmagnesiumchlorid, CH2Cl2, 267a 49%, 267b 32%, d) BAIB, TEMPO, CH2Cl2, 0 °C → RT, 268a 45%, 268b 54%, e) TBSCl, Imidazol, CH2Cl2, 0 °C → RT, 80%, f) DPPA, PPh3, DEAD, THF, 57%, g) PPh3, THF/H2O, 87%, h) Boc2O, NEt3, CH3OH, 65%, i) TBAF, THF,
86%.
Abbildung 74: Geplante Reaktionsschritte zur Synthese der Schlüsselbausteine 280 bzw. 285, Reagenzien und Bedingungen: a) TEMPO, BAIB, CH3CN/H2O, b) Boc2O, DMAP, tBuOH, c) 9-BBN, THF, dann NaHCO3, H2O2, d) (DHQD)2PYR, OsO4, K2CO3, K3Fe(CN)6, tBuOH/H2O, e) DMP, CH2Cl2, f) H2NOH x HCl, Pyridin, EtOH, g) NaBH3CN,
CH3OH, HCl, pH < 3, h) BuONO, NH3(g), EtOH, i) BnBr, NEt3, EtOAc, j) ZnBr2, CH2Cl2, k) AcCl, DMAP, Pyridin, l) TEMPO, BAIB, CH2Cl2, m) BnBr, NaH, THF, TBAI.