Quantitative Real Time (TaqMan) PCR

entfalten kann, werden die nicht hybridisierten Sondenmoleküle nicht abgebaut und es zeigt sich kein Fluoreszenzsignal.

Abbildung 3: TaqMan-Prinzip: Erst getrennt vom Quencher-Molekül (Q) wird die Reporter-Fluoreszenz (F) messbar und zeigt die Zielstrangsynthese in der PCR an (Eurogentec, Seraing, Belgien).

2.2.4.2 Verwendete Primer und Sonden

Tabelle 19 stellt die Basensequenzen der verwendeten Primer und TaqMan-Sonden dar. Sie wurden mit Hilfe der Primer Express Software (Version 2.0, Applied Biosystems, Foster City, CA) ausgewählt. Die Primer wurden von der Firma MWG Biotech AG, Ebersberg hergestellt.

Die TaqMan-Sonden wurden von dem Hersteller des TaqMan® qPCR MasterMixes (Eurogentec, Seraing, Belgien) synthetisiert und für die hier durchgeführte Real Time PCR von Herrn M. Kowalewski, AG Prof. Dr. Dr. h.c. B. Hoffmann, Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere mit Tierärztlicher Ambulanz der Justus-Liebig-Universität Giessen, zur Verfügung gestellt.

Tabelle 19: Die in der Real Time PCR verwendeten Primer und TaqMan-Sonden Sequenzen Primer Primersequenzen (5´→3´)

Amplifikat-größe

NCBI Acc.-Nr.

GAPDH forward primer

GCT GCC AAA TAT GAC GAC ATC A 75 bp AB028142 GAPDH

reverse primer

GTA GCC CAG GAT GCC TTT GAG 75 bp AB028142

GAPDH-TaqMan Sonde

TCC CTC CGA TGC CTG CTT CAC TAC CTT AB028142

VEGF 164 dog forward primer

GTG CCC ACT GAG GAG TTC AAC 72 bp AF133248

VEGF 164 dog reverse primer

CCC TAT GTG CTG GCC TTG AT 72 bp AF133248

VEGF 164 dog-TaqMan Sonde

CAC CAT GCA GAT TAT GCG GAT CAA ACC AF133248 VEGFR-1 dog

forward primer

TGC CTG AAA CAG TGA GAA AGG A 81 bp AF262963 VEGFR-1 dog

reverse primer

TGC AGA ACT GTT TGC CAT TCC 81 bp AF262963

VEGFR-1 dog-TaqMan Sonde

AAA GGC TGA GCA TTA CTA AAT CTG CCT AF262963 VEGFR-2 dog

forward primer

TGA CAT GGG CTC GGT CAT T 75 bp NM_001048024

VEGFR-2 dog reverse primer

TGT TGG TCG CTA ACA GAA GCA 75 bp NM_001048024

VEGFR-2 dog-TaqMan Sonde

CTA CGT TCA AGA TTA CAG GTC TCC ATT NM_001048024

2.2.4.3 Protokoll der Real Time RT-PCR für VEGF, VEGFR-1 und VEGFR-2

Bei der Durchführung der Real Time PCR wurde der TaqMan® qPCR MasterMix (Eurogentec, Seraing, Belgien) eingesetzt. Die jeweiligen Proben wurden auf eine Standard-Verdünnung der RNA-Lösung von 200 ng/µl gebracht und daraufhin der DNase-Behandlung unterzogen. Diese und die Reverse Transkription (RT) erfolgten nach den in Kapitel 2.2.3.5.

beschriebenen Protokollen. In Tabelle 20 ist die Zusammensetzung des Reaktionsansatzes für die Real Time PCR dargestellt. Zu 20 µl Reaktionsansatz wurden 5 µl cDNA-Lösung aus dem RT-Ansatz zugegeben. Für jede Probe wurde eine Doppelbestimmung durchgeführt.

Tabelle 20: Reaktionsansatz für die Real Time RT-PCR

Komponenten Einfacher Ansatz (in µl) Stammlösung qPCR Master Mix 12,5 µl 2x

Sense-Primer 1,5 µl 5 µM Antisense-Primer 1,5 µl 5 µM TaqMan-Sonde 1 µl 5 µM DEPC-Wasser 3,5 µl

Gesamtvolumen 20 µl

Durchgeführt wurde die Real Time PCR in dem automatischen Fluorometer ABI PRISM™

5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Darmstadt) unter Verwendung von 96-well optical plates (Applied Biosystems, Darmstadt).

Die Amplifikation wurde bei folgenden Reaktionsbedingungen durchgeführt:

Programmschritt Temperatur Dauer Initiale Denaturierung 95°C 10 min Denaturierung 95°C 15 sek Annealing=TA

und Verlängerung

60°C 1 min 40 Wiederholungen

2.2.4.4 Auswertung

Die ermittelte Quantifizierung der Expression eines Gens durch die Real Time PCR lässt sich in eine absolute und eine relative Quantifizierung unterscheiden. Bei der absoluten Quantifizierung ermittelt man die absolute Menge, also die Anzahl der Kopien eines Gens. In dem Fall benötigt man zur Erstellung einer Regressionsgeraden einen genauen Standard, zum Beispiel eine definierte Menge von Plasmid-DNA des entsprechenden Gens.

Bei der relativen Quantifizierung wird der Anstieg beziehungsweise der Abfall des Zielgens in Bezug auf ein Referenzgen ermittelt. Darum sollte das Housekeeping-Gene, welches zur Normierung der Daten verwendet wird, nicht reguliert sein, das heißt es sollte ein konstantes Expressionsniveau in verschiedenen Geweben, Stadien und unter verschiedenen experimentellen Bedingungen besitzen. Die Voraussetzung zur Anwendung der relativen Quantifizierung ist, dass Ziel- und Referenzgen-PCR vergleichbare Reaktionseffizienzen zeigen.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Methode der relativen Quantifizierung angewendet.

Dabei wurde das Housekeeping-Gene GAPDH (Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase)

nach Angaben des Herstellers von ABI PRISM™ 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Darmstadt) als Referenzgen eingesetzt.

Die Quantifizierung der PCR basiert auf der Berechnung des Fluoreszenz-Schwellenwertes, dem so genannten Treshold Cycle oder CT-Wert. Der CT-Wert ist jener PCR-Zyklus, bei welchem das Fluoreszenzsignal die Hintergrundfluoreszenz signifikant übersteigt. Zu Beginn der PCR-Reaktion wird nur die Basis- oder Hintergrundfluoreszenz gemessen, denn normalerweise ist die Fluoreszenz aufgrund der geringen Templatekonzentration im Reaktionsgefäß während der ersten PCR-Zyklen nicht detektierbar. Der CT-Wert definiert also jenen Zeitpunkt, ab dem die Amplifikation und damit die Bildung von Doppelstrang-cDNA exponentiell ist. In dieser Phase wird die PCR-Reaktion von keinen limitierenden Faktoren wie Primer- oder Nukleotidmangel oder nachlassende Enzymaktivität eingeschränkt.

Der CT-Wert ist umgekehrt proportional zum Logarithmus der ursprünglich in die Reaktion eingebrachten cDNA-Kopienzahl des entsprechenden Gens. Die erforderliche Anzahl an Zyklen, die nötig sind, bis das Fluoreszenzsignal über dem Hintergrund detektierbar ist, ist umso geringer, je mehr cDNA-Template initial vorhanden ist.

Die Bestimmung der relativen Expression setzt sich aus drei Formeln zusammen.

Als erstes wird der Unterschied an Tresholdzyklen für die Zielsequenz und das Referenzgen berechnet. Dabei wird auf das Housekeeping-Gene GAPDH normalisiert.

1. Formel: ΔCT = ΔCT Zielgen – ΔCT GAPDH

Bevor die relative Expression bestimmt werden kann, muss zunächst ΔΔCT bestimmt werden.

Hierfür wird ein Kalibrator ausgewählt. Als Kalibrator wird diejenige Probe bezeichnet, bei welcher die Expression am niedrigsten war (also die Probe mit dem höchsten ΔCT-Wert). Der ΔCT-Wert des Kalibrators wird von den ΔCT-Werten aller Proben abgezogen (2. Formel).

2. Formel: ΔΔCT = ΔCT Zielgen – ΔCT Kalibrator

Mit Hilfe des ΔΔCT kann dann die relative Gen-Expression (RGE) bestimmt werden (3. Formel).

3. Formel: RGE = 2^(-ΔΔCT)

Die relative Gen-Expression gibt die n-fache Überexpression eines Gens im Vergleich zu der Probe mit der niedrigsten Expression (Kalibrator) an.

2.2.4.5 Statistische Verfahren

Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe der Statistical Software GraphPad3 (GraphPad Software, Inc., San Diego, California, USA).

Zur statistischen Berechnung der VEGF-, VEGFR-1- und VEGFR-2- mRNA-Expression wurde eine einfaktorielle Varianz-Analyse (parametrische ANOVA) durchgeführt. An die Varianzanalyse schloss sich ein paarweiser Mittelvergleich mit Hilfe des Tukey-Kramer´s Tests an.