2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 M ATERIAL
Die untersuchten Plazenten stammen von insgesamt 23 Katzen und 43 Hunden. Die Plazenten wurden im Rahmen von Kastrationen gesunder, trächtiger Tiere entnommen. Dabei wurde ein Teil der Kastrationen in der Klinik für Geburtshilfe, Gynäkologie und Andrologie der Groß- und Kleintiere mit Tierärztlicher Ambulanz der Justus-Liebig-Universität Giessen (KGGA Giessen) durchgeführt, einige Kastrationen erfolgten in der Tierärztlichen Praxis Dr. med. vet.
U. Linzer in Koblenz und der Großteil des durch Kastrationen gewonnenen Materials stammt aus der Clinica Veterinària S.M. in Faro, Portugal.
Des weiteren war ein Teil des Materials bereits im Institut für Veterinäranatomie, -Histologie und -Embryologie der Justus-Liebig-Universität Giessen vorhanden und ein weiterer Teil der in Paraffin eingebetteten Gewebeproben stammt aus der Universität von São Paulo, Brasilien.
Das Graviditätsstadium war bei einem Teil der Tiere bekannt, in den meisten Fällen wurde dieses anhand des Entwicklungsstadiums der Feten und der histologischen Gewebeuntersuchung ermittelt. Die Einteilung des Graviditätsstadiums erfolgte in drei Kategorien: erstes Drittel, zweites Drittel und letztes Drittel der Gravidität.
Tabelle 2a: Plazentaproben des Hundes, geordnet nach dem Trächtigkeitsstadium
Präparat Trächtigkeitsstadium Bezugsquelle
Hd Plac 736/00lila Erstes Drittel Veterinäranatomie
Hd Plac 2/05 10 d Gest (Gestation) Universität von São Paulo, Brasilien
Hd Plac 3/05 10 d Gest Universität von São Paulo, Brasilien
Hd Plac 4/05 21 d Gest Universität von São Paulo, Brasilien
Hd Plac 5/05 21 d Gest Universität von São Paulo, Brasilien
Hd Plac 44/05 Erstes Drittel, recht früh Clinica Veterinària S.M., Portugal
Hd Plac 45/05 Erstes bis zweites Drittel Clinica Veterinària S.M., Portugal
Hd Plac 48/05 Erstes Drittel, früh Clinica Veterinària S.M., Portugal
Hd Plac 49/05 Erstes Drittel Clinica Veterinària S.M., Portugal
Hd Plac 50/05 Erstes (bis zweites) Drittel Clinica Veterinària S.M., Portugal
Hd Plac LB15 Erstes Drittel Clinica Veterinària S.M., Portugal
Hd Plac LB22 Erstes Drittel, sehr früh Clinica Veterinària S.M., Portugal
Hd Plac LB26 Erstes bis zweites Drittel Clinica Veterinària S.M., Portugal
Hd Plac 745/00A Zweites Drittel Veterinäranatomie
Hd Plac 7/05 40 d Gest Universität von São Paulo, Brasilien
Hd Plac 8/05 40 d Gest Universität von São Paulo, Brasilien
Hd Plac 47/05 Zweites Drittel Clinica Veterinària S.M., Portugal
Hd Plac 84/05 Zweites bis eher letztes Drittel
Clinica Veterinària S.M., Portugal
Hd Plac 85/05 Zweites Drittel Clinica Veterinària S.M., Portugal
Hd Plac 86/05 Zweites bis letztes Drittel Clinica Veterinària S.M., Portugal
Hd Plac 87/05 Zweites Drittel Clinica Veterinària S.M., Portugal
Hd Plac 88/05 Zweites Drittel Clinica Veterinària S.M., Portugal
Hd Plac 89/05 Zweites Drittel Clinica Veterinària S.M., Portugal
Hd Plac 215/05 LB3 31 d Gest KGGA, Giessen Hd Plac 216/05 LB3 31 d Gest KGGA, Giessen
Hd Plac 220/05 LB3 31 d Gest KGGA, Giessen Hd Plac 221/05 LB3 31 d Gest KGGA, Giessen
Hd Plac 129/06 LB4 Erstes bis zweites Drittel Tierärztliche Praxis, Koblenz Hd Plac 131/06 LB4 Erstes bis zweites Drittel Tierärztliche Praxis, Koblenz Hd Plac LB9 Zweites Drittel Clinica Veterinària S.M.,
Portugal
Hd Plac LB18 Zweites Drittel Clinica Veterinària S.M., Portugal
Hd Plac LB27 Zweites bis letztes Drittel Clinica Veterinària S.M., Portugal
Hd Plac LB29 Zweites Drittel Clinica Veterinària S.M., Portugal
Hd Plac 9/05 45 d Gest Universität von São Paulo, Brasilien
Hd Plac 10/05 45 d Gest Universität von São Paulo, Brasilien
Hd Plac 11/05 50 d Gest Universität von São Paulo, Brasilien
Hd Plac 12/05 50 d Gest Universität von São Paulo, Brasilien
Hd Plac 13/05 50 d Gest Universität von São Paulo, Brasilien
Hd Plac 14/05 55 d Gest Universität von São Paulo, Brasilien
Hd Plac 15/05 55 d Gest Universität von São Paulo, Brasilien
Hd Plac 16/05 55 d Gest Universität von São Paulo, Brasilien
Hd Plac LB12 Letztes Drittel Clinica Veterinària S.M., Portugal
Hd Plac LB24 In Geburt!!! Clinica Veterinària S.M., Portugal
Hd Plac LB25 Letztes Drittel Clinica Veterinària S.M., Portugal
Hd Plac Amy T58 58 d Gest KGGA, Giessen Hd Plac Kimba T60 60 d Gest KGGA, Giessen Hd Plac 1Senta T61 61 d Gest KGGA, Giessen
Tabelle 2b: Plazentaproben der Katze, geordnet nach dem Trächtigkeitsstadium
Präparat Trächtigkeitsstadium Bezugsquelle
Ktz Plac 22/04 20 d Gest Universität von São Paulo, Brasilien
Ktz Plac 23/04 20 d Gest Universität von São Paulo, Brasilien
Ktz Plac 132/06 LB5 Erstes Drittel KGGA, Giessen Ktz Plac 134/06 LB5 Erstes Drittel KGGA, Giessen
Ktz Plac 144/06 LB7 Erstes Drittel, früh Tierärztliche Praxis, Koblenz Ktz Plac 145/06 LB7 Erstes Drittel, früh Tierärztliche Praxis, Koblenz Ktz Plac LB13 Erstes Drittel? Clinica Veterinària S.M.,
Portugal
Ktz Plac LB19 Erstes Drittel, früh Clinica Veterinària S.M., Portugal
Ktz Plac LB20 Erstes Drittel Clinica Veterinària S.M., Portugal
Ktz Plac 408/00A Zweites Drittel Veterinäranatomie Ktz Plac 409/00A Zweites Drittel Veterinäranatomie Ktz Plac 207/01A Erstes bis zweites Drittel Veterinäranatomie
Ktz Plac 24/04 30 d Gest Universität von São Paulo, Brasilien
Ktz Plac 25/04 30 d Gest Universität von São Paulo, Brasilien
Ktz Plac 26/04 40 d Gest Universität von São Paulo, Brasilien
Ktz Plac 27/04 40 d Gest Universität von São Paulo, Brasilien
Ktz Plac 59/05 LB1 3-4 Wo KGGA, Giessen
Ktz Plac 60/05 LB1 3-4 Wo KGGA, Giessen
Ktz Plac 73/05 LB1 3-4 Wo KGGA, Giessen
Ktz Plac 74/05 LB1 3-4 Wo KGGA, Giessen
Ktz Plac 194/05 LB2 Zweites Drittel KGGA, Giessen Ktz Plac 195/05 LB2 Zweites Drittel KGGA, Giessen Ktz Plac 206/05 LB2 Zweites Drittel KGGA, Giessen Ktz Plac 207/05 LB2 Zweites Drittel KGGA, Giessen
Ktz Plac LB16 Zweites Drittel Clinica Veterinària S.M., Portugal
Ktz Plac LB28 Zweites Drittel Clinica Veterinària S.M., Portugal
Ktz Plac 199/01A Letztes Drittel Veterinäranatomie
Ktz Plac 28/04 60 d Gest Universität von São Paulo, Brasilien
Ktz Plac 152/06 LB8 Letztes Drittel KGGA, Giessen Ktz Plac 153/06 LB8 Letztes Drittel KGGA, Giessen
Ktz Plac LB10 Kurz vor Geburt Clinica Veterinària S.M., Portugal
Ktz Plac LB14 Letztes Drittel Clinica Veterinària S.M., Portugal
Ktz Plac LB17 Letztes Drittel Clinica Veterinària S.M., Portugal
2.1.1 Entnahme und Präparation der Proben
Nach der Entnahme der Uteri im Rahmen von Kastrationen wurden diese schnellstmöglich präpariert. Für die molekularbiologischen Untersuchungen wurden die Gewebeproben weitgehend steril entnommen und in steriler Alufolie in flüssigem Stickstoff schockgefroren oder sie wurden in RNAlater® überführt. Anschließend wurden diese Proben bis zu ihrer weiteren Verarbeitung bei -80°C gelagert.
Für die immunhistologischen Methoden wurden mit dem Skalpell Gewebeproben mit einer Größe von ca. 1 cm Länge x 1 cm Breite x 0,5 cm Tiefe aus mehreren Fruchtkammern herausgeschnitten. Diese Proben wurden 24 Stunden in Formalin fixiert und dann 3x im Abstand von ca. 10 Minuten in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und 2- 3 Tage lang mehrmals täglich in PBS gespült. Daraufhin wurden die Proben für 24 Stunden in 50%igen Ethanol und dann für mindestens 24 Stunden in 70%igen Ethanol überführt.
Nach dem Aufenthalt in 70%igem Ethanol wurden die Proben in 3 x 2 x 2 große Biopsiekörbchen verbracht und mit einem Vakuum-Gewebeinfiltrationsautomat (TP1050, Leica, Bensheim) entwässert und nach Xylol-Infiltration mit Paraffin durchtränkt. Die Entwässerung und Paraffinisierung des Gewebes geschieht nach folgendem Programm:
• 2 Stunden Ethanol 80 %
• 2 Stunden Ethanol 96 %
• 3 Stunden Ethanol 100 %
• 3 Stunden Ethanol 100 %
• 3 Stunden Ethanol 100 %
• 1 Stunde Xylol
• 45 Minuten Xylol
• 45 Minuten Xylol
• 40 Minuten Paraffin mit 59°C
• 40 Minuten Paraffin mit 59°C
• 40 Minuten Paraffin mit 59°C
Nach der Paraffinisierung wurden die Proben mit einer Ausbettstation (EG 1160, Leica) in 3 x 2 x 2 cm großen Stahlformen mit 60°C warmem Paraffin in Blöcke gegossen und zur Abkühlung und Härtung des Paraffins wurden die Formen auf die Kühlplatte des Gerätes gelegt.