Quantitative Bestimmung der Phosphorylierung

4.3 Methoden

4.3.3 Untersuchung der Wirkung des Rosuvastatin auf die Aktivität der

4.3.3.3 Quantitative Bestimmung der Phosphorylierung

humanen Erythrozyten mit Rosuvastatin

Eine Stocklösung mit 200ng/ml Rosuvastatin, 300mM L-Valin, 3mM L-Arginin sowie eine Stocklösung mit 300mM L-Valin und 3mM L-Arginin für die Kontrollinkubation wurden vorbereitet. Vollblut von vier gesunden Probanden wurde mit Lepirudin antikoaguliert. Durch Zentrifugation (800g, 20min, 4°C) wurden Erythrozyten und Plasma in speziellen Abtropfgefäßen voneinander getrennt und anschließend die reinen Erythrozyten im zellfreien Plasma im Verhältnis 1:1 resuspendiert. Das Erythrozytengemisch der vier Probanden wurde jeweils mit den vorbereiteten Stocklösungen im Verhältnis 10:1 vermischt, und dann für 30min bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert. Anschließend wurden die Erythrozyten als Ausstriche auf breiten Deckgläsern mit Methanol/Paraformaldehyd(37%)-Lösung (9:1, V:V) fixiert, mit PBS gewaschen und mit PBS/Triton-X-100 (0,1%) permeabilisiert. Danach wurden sie in einmolarer Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) nochmals gewaschen und für 20min in eine Lösung, bestehend aus PBS, H2O2 (2%) und Methanol (80%) gegeben. Die Ausstriche wurden mit Milchpulver (3%), gelöst in TBS, für 30min bei Raumtemperatur behandelt. Es folgte eine Inkubation in TBS mit Milchpulver (0,3%), Tween 20 (0,03%) und dem primären polyklonalen Kaninchen Antikörper gegen die phosphorylierte Form der eNOS an Ser¹¹⁷⁷ (1:500, Upstate, Lake Placid, NY). Nach Waschen der Proben mit TBS wurden die Ausstriche mit dem Zweitantikörper (1:400, goat-anti-rabbit-antibody, Dako, Glostrup, Dänemark) für 30min inkubiert. Ein Streptavidin-Peroxidase-Konjugat (Verdünnung 1:150) wurde den Ausstrichen für 30min hinzu gegeben. Die Reaktion wurde mit 3,3’-Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid gelöst in PBS durchgeführt. Die immunzytochemischen Untersuchungen der Erythrozytenausstriche wurden von Prof. W. Bloch und seinen technischen Assistenten/-innen an der Deutschen Sporthochschule Köln durchgeführt.

4.3.3.4 Gleichzeitige Messung der Plasmanitrit- und Nitratkonzentration, sowie der erythrozytären Aggregation und Verformbarkeit nach Inkubation von humanen Vollblutproben mit Rosuvastatin

4.3.4 Etablierung eines Inkubationsprotokolls zur Bestimmung der Aktivität der erythrozytären NOS im Tierversuch

4.3.4.1 Basale Aktivität der erythrozytären NOS während 30minütiger Inkubation mit und ohne Arginaseinhibition durch L-Valin

Die Abhängigkeit der erythrozytären NOS-Aktivität von der vorhandenen Plasma L-Arginin–

konzentration sollte quantifiziert werden. Weiterhin sollte der Einfluss der Arginase auf die basale Aktivität der erythrozytären NOS untersucht werden. Eine 300mM Lösung von dem Arginaseinhibitor L-Valin gelöst in PBS wurde angesetzt. Drei beliebigen Hunden des

Kollektivs wurden 25ml Blut abgenommen und mit Lepirudin antikoaguliert. 10ml des frisch entnommenen Vollblutes wurden im Verhältnis 10:1 mit 300mM L-Valin gelöst in PBS für 30min bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert. Weitere 10ml wurden entnommen, mit reinem PBS im Verhältnis 10:1 vermischt, und dann ebenfalls bei 37°C für 30min inkubiert.

Anschließend wurde die Plasmanitritkonzentration mittels reduktiver Chemilumineszenzdetektion (siehe 4.3.14) bestimmt. Die Plasmanitratkonzentration wurde in den folgenden Wochen mittels Nitrat-Reduktase-Flussinjektionsanalyse (siehe 4.3.15) bestimmt (Probenaufarbeitung siehe 4.3.3.1).

4.3.4.2 Bestimmung der Nitritbildung nach Inkubation mit verschiedenen L-Argininkonzentrationen mit und ohne Arginaseinhibition

Stocklösungen der verschiedenen Reagenzien gelöst in PBS wurden vorbereitet, sowie alle Materialien und Geräte, die für den Versuch notwendig waren aufgebaut. Das Vollblut wurde im Inkubationsversuch mit den Stocklösungen im Verhältnis 10:1 vermischt. Für den Versuch wurden folgende Stocklösungen verwendet: 30mM L-Arginin, 3mM L-Arginin, 3mM L-Arginin + 300mM L-Valin, 300µM L-Arginin und 300mM L-Valin. 10ml Vollblut von acht gesunden Probanden wurde mit Lepirudin antikoaguliert und anschließend mit den jeweiligen Reagenzien für 30min bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert. Nach Beendigung der Inkubation wurde jedem Inkubationsansatz ein Aliquot entnommen, und im plasmatischen Überstand die Nitrit- und Nitratkonzentration bestimmt (siehe 4.3.3.1).

4.3.4.3 Bestimmung der Nitritbildung nach Inkubation mit verschiedenen NOS-Inhibitoren

Die NOS-Inhibitoren N⁵-(1-Iminoethyl)-L-Ornithin (L-NIO), N^G, N^G-Dimethyl-L-Arginin (ADMA), S-Ethyl-N-{4-(Trifluoromethyl)Phenyl}Isothiourea (ETU), N^G-Monomethyl-L-Arginin (L-NMMA)

wurden auf ihre inhibitorische Wirkung untersucht. Aufgrund einer größeren Verfügbarkeit von Blut gesunder Probanden wurden die Inhibitoren zuerst an humanem Vollblut, und darauf folgend an caninem Vollblut getestet. Zuerst wurden Stocklösungen der Inhibitoren gelöst in PBS vorbereitet (L-NIO 1mM, ADMA 500 µM, ETU 1mM, L-NMMA 3mM). Alle Stocklösungen enthielten zusätzlich 300mM L-Valin. Eine Stocklösung mit L-Valin (500mM) gelöst in PBS diente der Kontrollinkubation. Vier gesunden Personen (weitere 3 für L-NIO) wurde 10ml Vollblut abgenommen. Das frisch entnommene Vollblut wurde dann direkt in die mit dem Agens gefüllten Reaktionsgefäße pipettiert und für 30min bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert. Das Vollblut wurde im Verhältnis 10:1 mit dem jeweiligen Agens vermischt, so dass die angestrebten Endkonzentrationen von 100µM L-NIO, 50µM ADMA, 100µM ETU, 300µM L-NMMA sowie 50mM L-Valin erreicht wurden. Nach Beendigung der Inkubation wurde jedem Inkubationsansatz ein Aliquot entnommen, und im plasmatischen Überstand die Nitrit- und Nitratkonzentration bestimmt (siehe 4.3.3.1). Der Versuch wurde mit Vollblutproben von drei gesunden Hunden auf gleiche Art und Weise wiederholt.

4.3.4.4 Bestimmung der Nitritbildung nach Inkubation mit verschiedenen eNOS-Stimulantien

Neun gesunden Personen wurde jeweils 10ml Vollblut entnommen. Die antikoagulierte Blutprobe wurde dann direkt in die vorbereiteten Reaktionsgefäße pipettiert und bei 37°C für 30min im Schüttelwasserbad inkubiert. Die Stocklösungen wurden mit Vollblut 1:10 verdünnt, so dass die Endkonzentrationen von 300µM L-Arginin, 300µM L-Arginin + 27,5µU Insulin und 300µM Arginin + 5mM Kalzium erreicht wurden. Alle Stocklösungen enthielten zusätzlich L-Valin, so dass eine Endkonzentration an L-Valin von 30mM in jedem Inkubationsansatz erreicht wurde. Nach Beendigung der Inkubation wurde jedem Inkubationsansatz ein Aliquot entnommen, und im plasmatischen Überstand die Nitrit- und Nitratkonzentration bestimmt (siehe 4.3.3.1).

Der Versuch wurde mit Vollblutproben von sechs gesunden Hunden auf gleiche Art und Weise wiederholt.

4.3.5 Untersuchung der Wirkung des Rosuvastatin auf die Aktivität der erythrozytären NOS im Tierversuch

Zur Differenzierung zwischen Effekten der erythrozytären NOS und der eNOS anderer Zellen, wurde ein speziell entwickeltes Inkubationsprotokoll verwendet. Vollblut von sechs gesunden Hunden wurde unter Kontrollbedingungen und 24h nach oraler Verabreichung von Rosuvastatin in Tablettenform (3mg/kg Körpergewicht) untersucht. Bei jeder Untersuchung wurde den Hunden insgesamt 58ml Vollblut abgenommen und mit Lepirudin (62,5µg/ml Vollblut) antikoaguliert. 2ml der Vollblutprobe wurden direkt bei der Blutentnahme mittels 2ml-Spritze in ein Reaktionsgefäß mit 8ml eisgekühltem PBS überführt und zur Gewinnung des Plasma für die Nitrit- und Nitratbestimmung sofort zentrifugiert (4°C, 800g, 20min). Das Plasma wurde abpipettiert und bis zur Messung des plasmatischen Nitritgehalt mittels reduktiver Chemilumineszenzdetektion auf Eis gelagert. Für die Nitratmessung mittels Nitratreduktase-Fluß-Injektions-Analyse wurde 1ml des Plasmas in der Zentrifuge mittels Ultrafiltrationsröhrchen (Centricon YM 10; ca. 3h, 2000g, 4°C) ultrafiltriert. 10ml der Vollblutprobe wurden ebenfalls in einem separaten Röhrchen zentrifugiert (4°C, 800g, 20min), um daraus Erythrozytenkonzentrat für die Messung der erythrozytären Verformbarkeit herzustellen. Das Erythrozytenkonzentrat wurde mittels PBS auf einen Hämatokrit von 35%

eingestellt und die erythrozytäre Verformbarkeit mit der modifizierten Filtrationsmethode als Dreifachmessung bestimmt. Weitere 45ml der Vollblutprobe wurden in ein Reaktionsgefäß mit 5ml L-Valin (500mM) gelöst in PBS überführt und dann unverzüglich in die drei vorbereiteten Reaktionsröhrchen für den Vollblutinkubationsassay überführt. Das Vollblut wurde im Verhältnis 1:10 mit PBS, L-Arginin (3mM) gelöst in PBS und ADMA (500µM) gelöst in PBS vermischt und dann bei 37°C für 30min im Schüttelwasserbad inkubiert. 1ml der Vollblutprobe diente zur Erstellung eines roten und weißen Blutbildes zur zusätzlichen Kontrolle des Gesundheitszustandes des Hundes. Aus einem weiteren Aliquot der Vollblutprobe von 100µl wurde mit dem Myrenne-Aggregometer die erythrozytäre Aggregation gemessen. Nach Abschluss der Inkubation wurde aus den drei Inkubationsansätzen ebenfalls der plasmatische Nitrit- und Nitratgehalt sowie die erythrozytäre Aggregation und Verformbarkeit bestimmt. Für

die Nitritmessung mittels reduktiver Chemilumineszenzdetektion wurde den drei Ansätzen je ein Aliquot von 800µl entnommen, welches dann im Verhältnis 1:5 mit eisgekühlten PBS verdünnt und sofort zur Plasmagewinnung durch Zentrifugation in seine plasmatischen und korpuskulären Bestandteile zerlegt wurde (4°C, 300g, 20min). Je 1ml des Plasmas von allen drei Ansätzen wurde für die spätere Bestimmung des Nitratgehaltes mittels Nitratreduktase-Fluß-Injektionsanalyse ultrafiltriert (Centricon YM 10; ca. 3h, 2000g, 4°C) und das Ultrafiltrat anschließend bis zur Messung bei -80°C gelagert. Ein 100µl Aliquot aus allen drei Ansätzen diente der sofortigen Bestimmung der erythrozytären Aggregation mittels Myrenne-Aggregometer. Aus dem Rest der drei Inkubationsansätze wurde durch Zentrifugation (4°C, 800g, 20min) Erythrozytenkonzentrat hergestellt. Dieses wurde mit PBS auf einen Hämatokrit von 35% eingestellt und direkt anschließend die erythrozytäre Verformbarkeit mit der modifizierten Filtrationsmethode als Dreifachmessung bestimmt. Das plasmatische Nitrit wurde direkt nach Abschluss der Messungen der erythrozytären Aggregation und Verformbarkeit der Inkubationsproben bestimmt und das plasmatische Nitrat in den darauf folgenden Wochen.

aus D: Inkubationsproben pipettieren: erythrozytären Aggregation

mit dem Blutabnahme und Aliquotierung des Vollbluts:

A: 10ml in Erythrozyten-Abtropfgefäß (+Lepirudin 0,25µl/ml) und direkt zentrifugieren B: 2ml direkt 1:5 in eisgekühltes PBS (+Lepirudin 0,25µl/ml) und direkt abzentrifugieren D: 45ml (+Lepirudin 0,25µl/ml)+5ml L-Valin (500mM)

E: 100µl (+Lepirudin 0,25µl/ml) für Myrenne-Aggregometer isolieren

F: 1ml in EDTA-Röhrchen für rotes und weißes Blutbild (direkt bestimmen)

Vorbereitung und Messung des Nitrit- Messung der erythrozytären Inkubationsassay und Nitratgehalts sowie der Aggregation

erythrozytären Verformbarkeit

Messung der Nitritkonzentration mittels Chemilumeneszenzdetektion und Lagerung des ultrafiltrierten Plasmas (je 2 Aliquots) bei -80°C für die Messung der plasmatischen Nitratkonzentration mittels Nitratreduktase-Fluß-Injektionsanalyse

Weitere Probenaufarbeitung aus 1. und 3.:

aus 1.: aus den 3 Ansätzen je 2x500µl verdünntes Plasma aliquotieren und für die Chemilumeneszenzdetektion auf Eis dunkel lagern und 1ml im Ultrafiltrationsröhrchen nochmals zentrifugieren (Centricon YM 10; ca. 3h, 2000g, 4°C)

aus 3.: aus den 3 Ansätzen Erythrozyten isolieren, mit PBS auf Hkt. 35% einstellen und mit der Filtration nach Reid die erythrozytäre Verformbarkeit der Inkubationsproben messen

Nach Beendigung der Inkubation werden die 3 Inkubationsproben wie folgt aliquotiert:

aus 1. 3x500µl VB aliquotieren und mit eisgekühltem PBS 1:5 verdünnen aus 2. 3x100µl VB in 1,5ml Eppendorfgefäß aliquotieren

aus 3. 3x10ml VB in Erythrozyten-Abtropfgefäß überführen aus B: 2x 500µl verdünntes Plasma aliquotieren und für die CLD kühl und dunkel lagern, 1ml ultrafiltrieren (s.u.)

aus A: Erythrozyten isolieren, mit PBS auf Hkt. 35% einstellen und mit der modifizierten Filtrationsmethode die basale Verformbarkeit bestimmen

1. und 3. zentrifugieren (800g, 4°C, 20min) Zeit:

Vorbereitung

Abb. 4.1: Protokoll für die Messung der erythrozytären Verformbarkeit, Aggregation und des Plasmanitritgehaltes, sowie für die Probenaufarbeitung der Nitratproben vor und nach Verabreichung von Rosuvastatin

4.3.14 Bestimmung der Plasmanitritkonzentration mittels reduktiver Chemilumineszenzdetektion

^156;157

Die Nitritkonzentration wurde mittels einer reduktiven jodhaltigen Reaktionslösung vollständig stöchiometrisch zu Stickstoffmonoxid umgewandelt und anschließend mittels einer Chemilumineszenzreaktion quantifiziert. Die NO-Detektion beruhte auf der Messung von Lichtquanten, die stöchiometrisch bei der Reaktion von NO mit Ozon (O3)abgegeben werden.

Als Detektor diente eine Anlage der Firma Ecophysics (Typ CLD 88 NO e). Zur Reduktion von Nitrit zu NO wurde eine jodhaltige Reaktionslösung (1,62 g Kaliumjodid, 0,57 g Iod, 30 ml, 200ml konzentrierte Essigsäure) verwendet, welche sich in einer auf 60°C erhitzten Reaktionskammer befand. Die reduktive Freisetzung von NO aus der Probe läuft dann nach folgender Reaktion ab:

NO2 - + 2 H⁺ → NO⁺ + H2O NO⁺ + I^- → ONI

2 ONI → 2 NO^. + I2

In die Reaktionskammer wurde direkt über eine Membran mittels einer gasdichten Spritze (Hamiltonspritze) die Probe appliziert. Nach jeder Probenaufgabe wurde die Spritze einmal mit Aceton, sowie sechsmal mit destilliertem Wasser gespült. Währendessen strömte über eine Glasfritte das Inertgas Helium in die Reaktionskammer hinein und transportierte das gasförmige NO in Richtung Detektor. Zur Befreiung möglicher mitgetragener Verunreinigungen aus der Probe passierte das mit der Probe angereicherte Gas eine Kühleinheit (4°C) sowie ein mit einmolarer Natronlauge gefülltes Gefäß, bevor es den Detektor erreichte. Durch Kondensation und Proteinfällung wurde somit eine Aufreinigung des

Probengasgemisches erreicht. Zur Bestimmung der Plasmanitritgehalte wurde Vollblut in auf 4°C gekühlter Phosphatpufferlösung (PBS) 1:5 verdünnt und sofort zentrifugiert (20min, 800g, 4°C) um den zellulären vom plasmatischen Anteil zu trennen. Diese Art der Probenaufarbeitung ermöglichte eine hohe Wiederfindungsrate des plasmatischen Nitrits. Zur Datenaufnahme und Verarbeitung wurde ein handelsüblicher PC mit der Software Eurochrome verwendet, welcher über eine Interfacebox mit dem Detektor verbunden war. Die Größe des Signals wurde als Fläche unter der Kurve bestimmt. Vor jeder Analyse wurde durch Aufgabe fünf wässriger Nitritstandards mit aufsteigenden Nitritkonzentrationen eine Kontrolle der Anlage durchgeführt. Hierbei diente sowohl die Signalstärke als auch die Steigung der Korrelationsgeraden der Standards als Qualitätskontrolle. Die Endkonzentrationen wurden errechnet aus der Fläche unter der Kurve dividiert durch die Steigung der Standards. Zur Messung von Plasmanitritproben, bei denen Endkonzentrationen im nanomolaren Bereich zu erwarten sind, wurden zur Eichung Standards von 0, 50, 100, 150 und 200 nM aufgegeben. Pro Probe wurde immer eine Dreifachmessung durchgeführt, als Endergebnis diente der Mittelwert. Für die Inkubationsversuche wurden ausschließlich Reagenzien verwendet, welche am selben Tag unter saubersten Bedingungen hergestellt wurden. Sämtliche verwendete Reagenzien wurden bei jedem Versuch auf eine mögliche Nitritverunreinigung getestet.

Abb. 4.2: Schematische Darstellung der reduktiven Chemilumineszenzdetektion.

Abb.4.3: Beispielchromatogramm: Aufgabe wässriger Nitritstandards als Kontrolle der Anlage für die reduktive Chemilumineszenzdetektion; je Standard wurde eine Dreifachmessung durchgeführt.

0nM 50nM 100nM 150nM 200nM

4.3.15 Bestimmung des Plasmanitratgehaltes mittels Nitrat-Reduktase-Flussinjektionsanalyse

^157;158

Im ersten Schritt wurde Nitrat mittels Nitratreduktase (NR) zu Nitrit reduziert. Hierfür wurden die zu untersuchenden Proben mit Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADPH), gelöst in Aqua ad injectabilia, sowie einer weiteren Lösung bestehend aus NR, Glucose-6-Phosphat (G6P) und Glucose-6-Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) gelöst in Aqua ad injectabilia und TRIS-HCl versetzt und bei 25°C für 1 Stunde inkubiert. Das in der Probe vorhandene Nitrat wurde so durch die NR unter Verbrauch von NADPH zu Nitrit reduziert.

NADP⁺, welches durch den Verbrauch aus der Reaktion entstanden war, wurde durch die G6PDH zu NADPH reduziert und so permanent dem Gleichgewicht der NR-Reaktion entzogen. So wurde eine vollständige Umwandlung des Nitrates zu Nitrit gewährleistet. Im zweiten Schritt wurde das so zu Nitrit überführte Nitrat basierend auf der Griess-Reaktion photometrisch quantifiziert. Nitratmessungen fanden ausschließlich am Plasmaultrafiltrat statt.

Die Ultrafiltration des Plasmas wurde durch Zentrifugation in Ultrafiltrationsröhrchen (Centricon YM 10; ca. 3h, 2000g, 4°C) erreicht. Das ultrafiltrierte Plasma wurde bis zur Durchführung der Messung bei -80°C gelagert.

Abb.4.4: Nitratreduktase- und Griess-Reaktion.

Naphtylendiamin ~ N=N ~Sulfanilamid

Sulfanilamid

+N≡N ~ Sulfanilamid Naphtylendiamin

λ=540 Reaktion von Nitrat

durch die NR Griess-Reaktion

4.3.16 Messung der erythrozytären Verformbarkeit mit der modifizierten Filtrationsmethode

Reid et al.¹⁵⁹ entwickelten 1976 eine einfache Methode zur ex vivo Bestimmung der erythrozytären Verformbarkeit: bei einem Unterdruck von 1,96kPa, erzeugt durch einen Peleusball, wurden die Erythrozyten durch einen dem Kapillardurchmesser entsprechenden Filter gesaugt und die Flußrate (ml/min) bestimmt. Die modifizierte Filtrationsmethode von Kumara et al. 2005¹⁶⁰ stellt eine Weiterentwicklung der von Reid et al. etablierten Filtrationsmethode dar: bei einem Unterdruck von 0,98kPa (~10cm Wassersäule) wurden reine Erythrozyten bei einem Hämatokrit von 35% in Puffer durch einen Filter mit der Porengröße von 5µm gesaugt, die Flußrate bzw. Passagezeit (ml/min) diente als Maß der erythrozytären Verformbarkeit. Der Unterdruck im Vakuumsystem wurde mit Hilfe einer elektrischen Vakuumpumpe erreicht, während ein Vakuumreservoir Druckschwankungen verminderte. Als Manometer diente eine sich in einer Glaskapillare befindliche Wassersäule, die auf 10cm geeicht war. Drei an das Vakuumsystem angeschlossene Filtratreservoirgefäße mit aufgestecktem Filterhalter und Membranfiltern von 5µm ermöglichten eine schnell hintereinander ablaufende Dreifachmessung. Vorab wurden die Erythrozyten durch Zentrifugation (20min, 800g, 4°C) in speziellen Erythozyten-Abtropfgefäßen von der restlichen Zellfraktion getrennt und mit Phosphatpufferlösung auf einen Hämatokrit von 35% eingestellt.

Die Flußrate (ml/min) wurde mittels Zeitschaltuhr dreimal für je 1ml Erythrozytengemisch bestimmt und als Endergebnis diente der Mittelwert.

Abb.4.5: Schematische Darstellung der modifizierten Filtrationsmethode.

4.3.17 Messung der erythrozytären Aggregation mit dem Myrenne-Aggregometer

Die erythrozytäre Aggregation wurde vollautomatisch mittels eines Erythrozyten-Aggregometers der Firma Myrenne GmbH gemessen (Erythrozyten Aggregometer MA1). 30 µl der Probe wurden in die Messkammer des Gerätes appliziert und mittels Infrarotbestrahlung die Lichtdurchlässigkeit bestimmt. Die Meßkammer bestand aus einem rotatorischen Platte-Kegel-System (Kegelwinkel: 2), dazwischen befand sich die Probe, welche je nach Aggregationszustand eine unterschiedliche Durchlässigkeit für das Infrarotlicht aufwies. Die Proben wurden sowohl im M-Mode nach einem Schergrad von 600/s als auch im M1-Mode nach einem Schergrad von 3/s während 10s vermessen. Das Ergebnis wurde im digitalen Display als mittleres Ausmaß der Aggregation durch die Rechnereinheit des Gerätes bestimmt. Pro Probe fand eine Dreifachmessung statt, als Endergebnis galt der Mittelwert.

Luftreservoir Wassersäule

(10 cm) Vakuum Pumpe

Filter (5 µm Porengroße)

Zeitschaltuhr

Probenapplikation

Tap

Abfall-Tap

4.3.18 Hämolysekontrolle mittels photometrischer Bestimmung der Plasmahämoglobinkonzentration

Da Erythrozyten intrazellulär hohe Nitritkonzentrationen besitzen, ist es für die Detektion der plasmatischen Nitritkonzentration besonders wichtig, eine Hämolyse der Erythrozyten und die damit verbundene Nitritverunreinigung zu vermeiden. Als Maß der Hämolyse diente die plasmatische Hämoglobinkonzentration. Mit einem Beckmann Photometer wurde bei einer Wellenlänge von 415nm die Absorption des Hämoglobins in Plasma bestimmt und dann mittels des Extinktionskoeffizienten (έ415=131000lmol^-1cm^-1) die Konzentration berechnet.

Abb. 4.6: Beispiel einer photometrischen Messung der Hämoglobinkonzentration bei λ=415nm

320 400 480 560

-0,4 0,0 0,4

Y Axis

X Axis

Absorbance (AU)

X=415 Area=0,196937561

4.3.19 Kontrolle des pH-Werts in Vollblut

Der pH-Wert der Inkubationsansätze, bestehend aus Vollblut und dem jeweiligen Agens wurde vor und nach der Inkubation mittels pH-Meter (WTW pH522) gemessen. Die Validierung des Gerätes wurde vor jeder Probenbestimmung mit Eichlösungen der pH-Werte 7 und 9 (Puffer 7,00, Puffer 9,00 Riedel-de Haën) durchgeführt.

4.3.20 Statistik

Die statistische Auswertung erfolgte unter Anwendung des Programm SPSS^® 12.0 für Windows (Chicago Ill., USA). Mit dem Test nach Shapiro-Wilk wurden die Daten auf Normalverteilung geprüft. Zur Überprüfung signifikanter Unterschiede zwischen zwei verschiedenen Gruppen von normalverteilten Daten wurde der t-Test angewendet. Der Wilcoxon-Test wurde zur Überprüfung signifikanter Unterschiede der Ergebnisse der erythrozytären Verformbarkeit durchgeführt, hierbei handelte es sich um verbundene, nicht normalverteilte Daten. Eine Einwege-ANOVA mit anschließendem Mittelwertvergleich nach Bonferoni diente zur Überprüfung der statistischen Signifikanz bei Ergebnissen mit mehr als zwei Gruppen. Als statistisch signifikant galt eine Irrtumswahrscheinlichkeit (p) von kleiner oder gleich 0,05. Die Ergebnisse wurden als Mittelwerte (MW) mit Standardfehler (SE), Stückzahl (n) und Signifikanz (p) oder als Pearson-Korrelation dargestellt. Zur graphischen Darstellung diente das Programm MicroCal Origin^® (Version 7.0 MicroCal Software Inc., North Hampton, MA, USA).

5 Ergebnisse

5.1 Aktivierung einer erythrozytären NOS durch Rosuvastatin in humanen Vollblutproben

Vor Durchführung des Tierversuches wurde in Vollblutproben von humanen Probanden die Wirkung des Rosuvastatin auf die erythrozytäre NOS-Aktivität ex vivo untersucht.

5.1.1 Dosis-Wirkungs-Kurve von Rosuvastatin

Frisch entnommenes Vollblut von neun gesunden Probanden wurde mit L-Valin und L-Arginin versetzt und dann mit verschiedenen Konzentrationen von Rosuvastatin für 30min bei 37°C inkubiert und anschließend die Plasmanitritkonzentration bestimmt. Nach Inkubation mit 20ng/ml Rosuvastatin war die höchste Plasmanitritkonzentration von im Mittel 68,8±8,0nM (n=9) im Vegleich zur Kontrolle (51,7±6,3nM, n=9) messbar. Der Anstieg nach Inkubation mit 10ng/ml und 30ng/ml Rosuvastatin erreichte Werte von 61,0±11,4nM (10ng/ml, n=9) und 62,3±8,2nM (30ng/ml, n=9). Nach Inkubation mit 40ng/ml Rosuvastatin war im Mittel kein Anstieg messbar (53,7±6,4nM, n=9) (Abb. 5.1 A). Die Unterschiede waren nicht signifikant (Einwege-ANOVA). Von neun Vollblutproben von verschiedenen Probanden zeigten n=5 die höchste Nitritkonzentration bei 20ng/ml Rosuvastatin, während n=2 einen höheren Wert bei 30ng/ml erreichten und jeweils ein Proband bei 10ng/ml und 40 ng/ml die höchste plasmatische Nitritkonzentration erreichte (Abb. 5.1 B).

A B

Abb. 5.1: Vollblutinkubation mit verschiedenen Konzentrationen an Rosuvastatin (A);

Darstellung der höchsten NO-Produktion bei verschiedenen Konzentrationen von Rosuvastatin im Vergleich zur Kontrolle (B).

5.1.2 Bestimmung der Nitritbildung nach gleichzeitiger Inkubation mit dem NOS-Inhibitor L-NMMA und Rosuvastatin

Vollblut von fünf gesunden Probanden wurde unter Arginaseinhibition und Überschuss an L-Arginin für 30min bei 37°C mit Rosuvastatin (20ng/ml), mit Rosuvastatin und dem NOS-Inhibitor L-NMMA oder nur mit L-NMMA inkubiert. Nach gleichzeitiger Inkubation mit L-NMMA und Rosuvastatin kam es zu einem signifikanten Abfall der Plasmanitritkonzentration auf 46,6±4,0nM (n=5, p<0,05), im Vergleich zur Inkubation mit Rosuvastatin allein, welche im Mittel Werte von 64,3±4,5nM (n=5) erreichte. Nach Inkubation mit L-NMMA allein wurden ebenfalls erniedrigte Werte von im Mittel 43,9±2,0nM erreicht (n=3, p<0,05, siehe Abb. 5.2).

Abb. 5.2: Nitritkonzentrationen nach Inkubation von humanem Vollblut mit Rosuvastatin, Rosuvastatin und L-NMMA und L-NMMA.

5.1.3 Quantitative Bestimmung der eNOS-Phosphorylierung nach

Inkubation mit Rosuvastatin

5.1.3 Quantitative Bestimmung der eNOS-Phosphorylierung nach

Inkubation mit Rosuvastatin

Im Dokument Aktivierung der erythrozytären No-Synthase durch Rosuvastatin (Seite 50-78)