Aus dem Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
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Aktivierung der erythrozytären NO-Synthase durch Rosuvastatin
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Barbara Ludolph
aus Düsseldorf
Hannover 2007
Wissenschaftliche Betreuung: Priv.-Doz. Dr. M. Gernert
1. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. M. Gernert
2. Gutachter: Prof. Dr. M. Ganter
Tag der mündlichen Prüfung: 21.05.07
„Das Lernen ist wie ein Meer ohne Ufer.“
Konfuzius
Für Philipp und meine Eltern
in Liebe und Dankbarkeit gewidmet
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung... 1
2 Literaturübersicht... 3
2.1 NO-Synthasen ...3
2.2 Regulation konstitutiver NO-Synthasen ...5
2.3 Metabolismus von Stickstoffmonoxid ...10
2.4 Einfluss von NO auf die erythrozytäre Aggregation und Verformbarkeit ...13
2.5 Die erythrozytäre NO-Synthase ...16
2.6 Rosuvastatin ...18
3 Zielsetzung ... 23
4 Material und Methoden... 25
4.1 Material...25
4.1.1 Vollblutproben von gesunden Probanden ...25
4.1.2 Vollblutproben von gesunden Hündinnen ...25
4.1.3 Übersicht über die verwendeten Proben ...26
4.1.4 Verwendete Substanzen und Reagenzien für die Vollblutinkubation ...27
4.1.5 Verwendete Substanzen und Reagenzien für die Nitritmessung mittels reduktiver Chemilumineszenz-detektion ...27
4.1.6 Verwendete Substanzen und Reagenzien für die Nitratmessung mittels Fluß-Injektions-Analyse ...28
4.1.7 Verwendete Substanzen und Reagenzien für die modifizierte Filtrationsmethode ...29
4.1.8 Verwendete Substanzen und Reagenzien für den immunhistochemischen Nachweis der phosphorylierten Form der eNOS...29
4.1.9 Verwendete Substanzen und Reagenzien zur Messung des Blut-pH Wertes ...30
4.2 Material und Geräte...31
4.2.1 Materialien zur Gewinnung von Vollblutproben...31
4.2.2 Materialien für die Vollblutinkubation ...31
4.2.3 Materialien und Geräte für die Nitritmessung mittels reduktiver Chemilumineszenzdetektion ...32
4.2.4 Materialien und Geräte für die Nitratmessung mittels Fluß-Injektions-Analyse ...33
4.2.5 Materialien und Geräte für die modifizierte Filtrationsmethode ...33
4.2.6 Materialien und Geräte für den immunhistochemischen Nachweis der phosphorylierten Form der eNOS...35
4.2.7 Materialien und Geräte für die photometrische Messung der Hämoglobinkonzentration in Plasma...35
4.2.8 Materialien und Geräte zur Messung des Blut-pH ...35
4.3 Methoden...36
4.3.1 Blutabnahme bei Probanden...36
4.3.2 Blutabnahme bei Hunden...36
4.3.3 Untersuchung der Wirkung des Rosuvastatin auf die Aktivität der erythrozytären NOS in humanen Vollblutproben...36
4.3.3.1 Dosis-Wirkungs-Kurve von Rosuvastatin ex vivo in humanen Vollblutproben ...36
4.3.3.2 Bestimmung der Nitritbildung nach gleichzeitiger Inkubation mit dem NOS-Inhibitor L-NMMA und Rosuvastatin in humanen Vollblutproben ...37
4.3.3.3 Quantitative Bestimmung der Phosphorylierung der erythrozytären NOS an Serin 1177 nach Inkubation von humanen Erythrozyten mit Rosuvastatin...38
4.3.3.4 Gleichzeitige Messung der Plasmanitrit- und Nitratkonzentration, sowie der erythrozytären Aggregation und Verformbarkeit nach Inkubation von humanen Vollblutproben mit Rosuvastatin...39 4.3.4 Etablierung eines Inkubationsprotokolls zur Bestimmung
der Aktivität der erythrozytären NOS im Tierversuch ...39 4.3.4.1 Basale Aktivität der erythrozytären NOS während 30minütiger
Inkubation mit und ohne Arginaseinhibition durch L-Valin...39 4.3.4.2 Bestimmung der Nitritbildung nach Inkubation mit verschiedenen
L-Argininkonzentrationen mit und ohne Arginaseinhibition ...40 4.3.4.3 Bestimmung der Nitritbildung nach Inkubation mit
verschiedenen NOS-Inhibitoren ...40 4.3.4.4 Bestimmung der Nitritbildung nach Inkubation mit
verschiedenen eNOS-Stimulantien ...41 4.3.5 Untersuchung der Wirkung des Rosuvastatin auf die Aktivität
der erythrozytären NOS im Tierversuch...42 4.3.14 Bestimmung der Plasmanitritkonzentration mittels reduktiver
Chemilumineszenzdetektion ...45 4.3.15 Bestimmung des Plasmanitratgehaltes mittels Nitrat-Reduktase-
Flussinjektionsanalyse ...48 4.3.16 Messung der erythrozytären Verformbarkeit mit der modifizierten
Filtrationsmethode ...49 4.3.17 Messung der erythrozytären Aggregation mit dem
Myrenne-Aggregometer ...50 4.3.18 Hämolysekontrolle mittels photometrischer Bestimmung der
Plasmahämoglobinkonzentration ...51 4.3.19 Kontrolle des pH-Werts in Vollblut ...52 4.3.20 Statistik ...52
5 Ergebnisse... 53
5.1 Aktivierung einer erythrozytären NOS durch Rosuvastatin in humanen Vollblutproben ...53 5.1.1 Dosis-Wirkungs-Kurve von Rosuvastatin ...53 5.1.2 Bestimmung der Nitritbildung nach gleichzeitiger Inkubation mit
dem NOS-Inhibitor L-NMMA und Rosuvastatin...54 5.1.3 Quantitative Bestimmung der eNOS-Phosphorylierung
nach Inkubation mit Rosuvastatin ...55 5.1.4 Gleichzeitige Messung der plasmatischen Nitrit- und Nitratkonzentration,
sowie der erythrozytären Aggregation und Verformbarkeit nach Inkubation mit Rosuvastatin ...56 5.2 Etablierung einer caninen Vollblutinkubation als Assay
für die Aktivität der erythrozytären NOS im Tierversuch ...59 5.2.1 Basale Aktivität der caninen erythrozytären NOS
während 30minütiger Inkubation mit und ohne
Arginaseinhibition durch L-Valin...59 5.2.3 Bestimmung der Nitritbildung nach Inkubation
mit verschiedenen L-Argininkonzentrationen mit und ohne Arginaseinhibition durch L-Valin ...60 5.2.4 Bestimmung der Nitritbildung nach Inkubation
mit verschiedenen NOS-Inhibitoren ...61 5.2.5 Bestimmung der Nitritbildung nach Inkubation
mit verschiedenen eNOS-Stimulantien ...62 5.3 Tierversuch: Bestimmung der Aktivität der erythrozytären NOS
nach Verabreichung von Rosuvastatin ...63 5.3.1 Gleichzeitige Messung der plasmatischen Nitrit- und Nitratkonzentration,
sowie der erythrozytären Aggregation und Verformbarkeit vor und nach Verabreichung von Rosuvastatin...63
5.3.2 Bestimmung der Plasmanitritkonzentration vor und nach Verabreichung von Rosuvastatin
mittels Inkubationsprotokoll in caninen Vollblutproben...65
5.4 Hämoglobingehalt ...66
5.5 pH-Wert...66
6 Diskussion ... 67
6.1 Aktivierung der erythrozytären NOS durch Rosuvastatin ...68
6.2 Erstellung und Anwendung eines Inkubationsassay zur Bestimmung der Aktivität der erythrozytären NOS im Tierversuch ...70
6.3 Wirkung des Rosuvastatin auf die erythrozytäre Verformbarkeit ...74
6.4 Wirkung des Rosuvastatin auf die erythrozytäre Aggregation...76
5 Zusammenfassung ... 79
8 Summary ... 81
9 Literatur ... 83
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
ADMA Asymmetrisches Dimethylarginin
AE-1 Anionenaustauscher-1
AMP Adenosinmonophosphat
AMPK AMP-aktivierte Proteinkinasen ATP Adenosintriphosphat
BAT Breitbandaminosäuretransporter BH4 Tetrahydrobiopterin
CaM Calmodulin
cAMP zyklisches Adenosin-Monophosphat
CAT Kationischer Aminosäuretransporter
cGMP zyklisches Guanosinmonophosphat
cNOS konstitutive NO-Synthase
DDAH Dimethylarginin-Dimethylaminohydrolase
EC Endothelzelle
EDRF endothelial-derived relaxing factor
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
eNOS endotheliale NO-Synthase
ETU S-Ethyl-N-{4(Trifluoromethyl)Phenyl}Isothiourea FAD Flavin-Adenosin-Dinukleotid
FMN Flavin-Mononukleotid
FPP Farnesylpyrophosphat
GDP Guanosindiphosphat
GGPP Geranylgeranylpyrophosphat
G6P Glukose-6-Phosphat
G6PDH Glukose-6-Phosphat Dehydrogenase
GTP Guanosintriphosphat
HDL high density Lipoprotein
HMG-CoA ß-Hydroxy ß-Methyl Glutaryl Coenzym A
HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie
Hsp90 Hitzeschock-Protein 90
iNOS induzierbare NO-Synthase
KHK Koronare Herzkrankheit
Ki Inhibitionskonstante
LDL low density Lipoprotein
L-NAME Nω-Nitro-L-Arginin Methylester L-NIO N5-(1-Iminoethyl)-L-Ornithin L-NMMA NG-Monomethyl-L-Arginin
mRNA messenger Ribonukleinsäure
NADP+ Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat
NADPH Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (reduziert)
nNOS neuronale NO-Synthase
NOS NO-Synthase
NR Nitratreduktase
PBS Phosphatgepufferte Kochsalzlösung
PeNOS Phosphorylierte eNOS
PKC Proteinkinase C
PRMTs Protein Arginin N-Methyltransferasen
RNNO Nitrosamine
RSNO Nitrosothiole
ROS Reaktive Sauerstoffradikale
SDMA symmetrisches Dimethylarginin
s.o. siehe oben
s.u. siehe unten
TBS Tris-Bor-Säure TRIS-HCL Tris-Salzsäure
u.a. unter anderem
VLDL very low density Lipoprotein
z.B. zum Beispiel
1 Einleitung
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein wichtiges inter- und intrazelluläres Signalmolekül, das sowohl im kardiovaskulären als auch im Nerven- und Immun-System an der Vermittlung biologisch relevanter Funktionen beteiligt ist. Im kardiovaskulären System beeinflusst das von endothelialen NO-Synthasen (eNOS) gebildete NO unter anderem den Gefäßtonus, die regionale myokardiale Funktion, das Gefäßwachstum, sowie die Leukozyten-, Thrombozyten und Erythrozytenfunktion1;2. Erst in den letzten 20 Jahren konnte die parakrine Wirkung von NO auf die Gefäßwand identifiziert werden: 1980 entdeckten Furchgott, Murad und Ignarro gleichzeitig und unabhängig voneinander einen sekundären Botenstoff (Endothelium derived relaxing factor, EDRF), der nach Stimulation der unversehrten Gefäßwand mit Acetylcholin gebildet wurde und später als NO identifiziert werden konnte 3-5. Das kontinuierlich freigesetzte NO aktiviert die lösliche Guanylatzyklase der glatten Muskelzelle der Gefäßwand und reguliert über die herbeigeführte Vasodilatation den Blutfluss6.
Die bekannten klassischen kardiovaskulären Risikofaktoren des Menschen, wie Hypercholesterinämie, arterielle Hypertonie, Nikotinkonsum und Diabetes mellitus, gehen mit einem Verlust dieser NO-vermittelten Vasodilatation einher. Dieser Verlust der endohelvermittelten Vasodilatation ist das Kennzeichen einer "endothelialen Dysfunktion", die bereits in der Frühphase der Arteriosklerose nachweisbar und ursächlich mit dieser Erkrankung verbunden ist1. Kardiovaskuläre Erkrankungen, insbesondere ein Herzinfarkt oder ein Hirninfarkt, entstehen häufig auf dem Boden arteriosklerotisch veränderter Gefäße. Sie stellen in Deutschland nach wie vor die häufigste Todesursache des Menschen dar. Nach Angaben des Statistischen Bundesamtes starben im Jahr 2003 396.622 Menschen an den Folgen einer Herz-Kreislauf-Erkrankung. Darunter erlagen 92.673 Menschen einem akuten Herzinfarkt und 39.286 Menschen einem Schlaganfall. Die koronare Herzkrankheit (KHK) war 2003 sowohl bei Männern als auch bei Frauen die häufigste Todesursache.
Statine oder HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren sind cholesterinsenkende Pharmaka, welche heutzutage weltweit bei Patienten mit KHK zum Einsatz kommen. Die cholesterinsenkende Wirkung der Statine wurde schon 1978 erkannt. Goldstein et al7 untersuchten die aus Penicilium ssp. isolierte Substanz Compactin und fanden heraus, dass diese kompetitiv die HMG-CoA-Reduktase der Cholesterinbiosynthese inhibiert. Durch Herstellung synthethischer und semisynthetischer Statine wurde die Effektivität und Selektivität deutlich verbessert. So kommt es selektiv zu einer Senkung der low density Lipoproteine (LDL) und zu einem Anstieg der high density Lipoproteine (HDL). Neben ihrer Cholesterinsenkenden Wirkung besitzen Statine noch diverse andere vasoprotektive Eigenschaften. Zu diesen gehört neben ihrer antiinflammatorischen und antioxidativen Wirkung insbesondere eine Aktivierung endothelialer NO-Synthasen (eNOS)8;9.
Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass neben der Endothelzelle auch Erythrozyten eine NO-Synthase besitzen, welche in physiologisch relevanten Mengen NO synthetisiert und exportiert. Diese NO-Synthase ist durch ihr Substrat L-Arginin beeinflussbar, welches bei einer Bereitstellung eine gesteigerte Syntheserate und NO-vermittelte Veränderungen der Rheologie bewirkt10. Bislang war nicht eindeutig geklärt, um welche NOS-Isoform es sich bei der erythrozytären NOS handelt. Unterschiedliche Ergebnisse, die entweder eine eNOS oder Kreuzreaktionen für verschiedene Isoformen beschreiben, liegen vor11;12. In Untersuchungen der eigenen Arbeitsgruppe am Modell der eNOS-Knock-Out Maus konnte die erythrozytäre NOS eindeutig als endotheliale Isoform charakterisiert werden10. Ob Statine in der Lage sind, diese erythrozytäre NO-Synthase zu aktivieren, ist bislang nicht bekannt.
2 Literaturübersicht
2.1 NO-Synthasen
Zu Beginn der achtziger Jahre wurde die Entdeckung gemacht, dass die gefäßrelaxierende Wirkung bestimmter Stoffe, wie z.B. Acetylcholin und Histamin, von der Unversehrtheit des Gefäßendothels abhängig ist. Es wurde die Existenz eines sekundär freigesetzten Faktors postuliert, der in Endothelzellen gebildet wird und anschließend in den glatten Gefäßmuskelzellen eine Relaxation herbeiführt. Man nannte diesen Faktor endothelium- derived relaxing factor (EDRF)3. Später konnte EDRF als NO identifiziert werden4;13, welches die beobachtete Gefäßdilatation über die Stimulation der cytosolischen Guanylatzyklase und der damit einhergehenden Erhöhung der intrazellulären zyklischen Guanosinmonophosphat (cGMP)-Konzentration der glatten Gefäßmuskelzelle bewirkte14;15. Die Biosynthese von NO konnte auch in anderen Geweben und Zelltypen nachgewiesen werden, z.B. im zentralen Nervensystem16 und in bestimmten Zellen des Immunsystems17. Weitere Untersuchungen ergaben, dass die Bildung des NO von einer Familie von Enzymen, den NO-Synthasen (NOS), katalysiert wird. Bisher sind drei Isoformen dieser Enzymfamilie bekannt, die alle als Homodimere vorliegen. Dabei handelt es sich um eine neuronale (nNOS, NOSI), eine induzierbare (iNOS, NOSII) und eine endotheliale (eNOS, NOSIII) NOS-Isoform, die sich hinsichtlich ihres genetischen Ursprunges, ihrer Lokalisation im Säugetierorganismus sowie ihrer Regulation und katalytischen Eigenschaften unterscheiden18;19. Die konstitutiv exprimierten Enzyme nNOS und eNOS, auch als konstitutive NOS (cNOS) bezeichnet, sind für die kontinuierliche Synthese des NO als Signalmolekül im neuronalen und kardiovaskularen System verantwortlich. Die iNOS wird im Rahmen der unspezifischen Immunabwehr insbesondere von Makrophagen als Reaktion auf ein toxisches Agens exprimiert, wodurch temporär wesentlich höhere, zytotoxische NO-Konzentrationen produziert werden können. Die Aktivierung der konstitutiven NOS wird nach Rezeptorstimulation durch extrazelluläre Signale, wie z.B. einem Anstieg der Schubspannung im Gefäß oder durch Freisetzung rezeptorabhängiger physiologischer Stimulatoren (z.B. Acetylcholin, Histamin,
Serotonin, Bradykinin), über einen Anstieg der Ca2+-Konzentration mit nachfolgender Calmodulin(CaM)-NOS Assoziation vermittelt19-21. CaM ist ein Ca2+-bindendes Protein, welches in einer Vielzahl eukariotischer Zellen vorkommt 22;23. Es kontrolliert den Elektronenfluss zwischen der Reduktase- und der Oxygenase-Domäne der NOS, so dass der Anstieg der Ca2+-Konzentration die NO-Bildung induziert24. Die NOS katalysiert die Reaktion von L-Arginin, Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NADPH) und Sauerstoff zu NO, L- Citrullin und Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NADP+). Hierfür benötigt sie die Kofaktoren Tetrahydrobiopterin (BH4), Flavin-Adenosin-Dinukleotid (FAD), Flavin- Mononukleotid (FMN) und das Eisen-Protoporphyrin (Haem), mit denen sie eine enge Bindung eingeht. NADPH assoziiert mit seiner Bindungsstelle auf der Reduktase-Domäne und gibt ein Elektron ab, welches mittels der Redox-Carrier FAD und FMN in Richtung Oxygenase-Domäne transportiert wird und nach Interaktion mit BH4 und Haem zur aktiven Seite des Enzyms gelangt. An der aktiven Seite der Oxygenase-Domäne läuft dann die Reaktion von L-Arginin und Sauerstoff zu L-Citrullin und NO ab (siehe Abb.1)19.
Reduktase-Domäne Oxygenase-Domäne
Abb.2.1: Schematische Darstellung der von NO-Synthasen katalysierten Reaktion und des Elektronenflusses zwischen Reduktase- und Oxygenase-Domäne
Calmodulin Ca2+
Calmodulin Ca2+
BH4
FAD e- FMN
e-
e-
Fe NADPH
NADP+ H+
L-Arginin O2
L-Citrullin NO
2.2 Regulation konstitutiver NO-Synthasen
Die klassische Aktivierung der NOS erfolgt über einen Anstieg der intrazellulären Ca2+
Konzentration20. Die eNOS ist in ihrer inaktiven Form in der Zelle über einen Myristoyl- und einen Palmitoyl-Rest in der Plasmamembran verankert, wo sie in Caveolae genannten lipidreichen Mikrodomänen lokalisiert ist25. Die ebenfalls in den Caveolae lokalisierten Proteine der Caveolin-Familie inhibieren direkt die Aktivität der NOS. Die Assoziation von Caveolin, sowie dessen inhibitorische Wirkung werden durch die Bindung von Ca2+/Calmodulin aufgehoben26. Durch die Bindung mit zwei Ca2+/Calmodulin Komplexen geht das Enzym in seine aktive Form über19 und dissoziiert von der Plasmamembran ins Zytosol27;28. Die Aktivierung wird von Signalwegen ausgelöst, die eine Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration herbeiführen. Die Erhöhung der Ca2+-Konzentration kann einerseits durch einen Ca2+-Einstrom aus der Umgebung durch Ionenkanäle in der Plasmamembran geschehen, die durch Liganden, Spannungsänderungen, mechanische Reize oder intrazelluläre Faktoren aktiviert werden. Ebenso bedeutend ist die Rezeptor- vermittelte Ca2+-Freisetzung aus intrazellulären Ca2+-Speichern. Die Bindung bestimmter Hormone und Neurotransmitter an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs, für 'G-Protein- Coupled Receptors') kann zu einer solchen intrazellulären Ca2+-Freisetzung führen29.
Endogene Inhibitoren können als autokrine Mediatoren die NOS-Aktivität regulieren. Hierbei handelt es sich um die methylierten L-Arginin Analoga Nω-Monomethyl-L-Arginin (L-NMMA) und das asymmetrische Dimethylarginin (ADMA), welche die NOS kompetitiv in ihrem aktiven Zentrum hemmen. Symmetrisches Dimethylarginin (SDMA) zeigt keine inhibitorische Wirkung auf die NOS30. Das Verhältnis des intrazellulär vorhandenen L-Arginin zu ADMA und L- NMMA reguliert somit die NOS-Aktivität. Asymmetrisch methylierte L-Arginin Analoga entstehen zum einen beim Abbau methylierter Proteine31 und zum anderen durch den enzymatischen Umbau durch N-Methyltransferasen (PRMTs). Bislang sind fünf verschiedene Isoformen von PRMTs identifiziert worden, welche zur Synthese von asymmetrisch methylierten L-Argininanaloga befähigt sind32. PRMTs katalysieren die Methylierung der
Guanidino N-Gruppe des L-Arginin. Als Donor der Methylgruppe dient S-Adenosylmethionin, welches als Zwischenprodukt bei der Umwandlung von Methionin zu Homocystein entsteht30. Der Hauptanteil des gebildeten ADMA und L-NMMA wird intrazellulär von der Dimethylarginin-Dimethylaminohydrolase (DDAH) abgebaut. Ein Teil des gebildeten ADMA und L-NMMA sowie das gesamte gebildete SDMA gelangt aus der Endothelzelle ins Plasma und wird dann über die Niere ausgeschieden30. ADMA erreicht im Plasma zehnmal höhere Konzentrationen als L-NMMA33. Ein Zusammenhang zwischen erhöhten Plasma-ADMA- Werten und kardiovaskulären Risikofaktoren, wie Bluthochdruck 34, Diabetes35, zunehmendem Alter36 und Hypercholesterinämie30, konnte gezeigt werden. Bislang sind zwei DDAH-Isoformen (DDAH I und DDAH II) beschrieben worden. Die Expression der DDAH I kommt verstärkt in nNOS exprimierenden Zellen vor, während die Expression der DDAH II in eNOS exprimierenden Zellen überwiegt32;37. Durch Untersuchungen der DDAH-Expression in der Niere von Ratten wurde eine Kolokalisation von NOS und DDAH festgestellt38,was Anlass zur Vermutung gibt, dass die NOS-Aktivität über einen intrazellulären ADMA/L-NMMA-Level hauptsächlich über die DDAH-Aktivität reguliert wird, während von einer konstanten Syntheseleistung der PRMTs ausgegangen wird32;37. Diese Hypothese wurde durch Untersuchungen an Endothelzellen mit dem DDAH-Inhibitor 4124W (S-2-Amino-4(3- methylguanidino)buttersäure) gestützt: durch den Einsatz von 4124W an kultivierten Endothelzellen konnte eine erhöhte Anflutung von ADMA im Zellüberstand provoziert werden, während die Konzentration an SDMA konstant blieb39.
L-Arginin:
NH NH2 II I
NH2—C—NHCH2CH2CH2CH—COOH
L-NMMA:
NH NH2 II I CH2—NH---C—NHCH2CH2CH2CH—COOH
ADMA:
CH2 NH NH2 I II I CH2—N---C—NHCH2CH2CH2CH—COOH
SDMA:
NH CH2 NH2 I I CH2—NH---C—NHCH2CH2CH2CH—COOH
Abb. 2.2: Chemische Struktur von L-Arginin und den methylierten L-Argininanaloga L-NMMA, ADMA und SDMA
Einen weiteren Einflussfaktor auf die NOS-Aktivität stellt die Bereitstellung ihres Substrates L- Arginin dar. Die semiessentielle kationische Aminosäure L-Arginin gelangt neben dem y+L- System und B0,+-System, hauptsächlich durch das y+-System in die Endothelzelle40. Das y+- System ist als einziges System selektiv für kationische Aminosäuren. Danach werden die Transportsysteme auch in kationische Aminosäuretransporter (CAT) und Breitband-
Aminosäuretransporter (BAT) eingeteilt. Bislang sind drei Isoformen der CAT Familie identifiziert worden: CAT-1, CAT-2A, CAT-2(B) und CAT-3. Der Begriff y+ beschreibt die Aktivität und Expression der Gesamtheit der kationisch selektiven Transporter41. Über ein negatives Membranpotential des Transporters kommt es zur Akkumulation und Einschleusung der Aminosäuren40. Der Transporter ist sensitiv gegenüber Transstimulation.
Eine Sättigung liegt unter physiologischen Bedingungen bei einer L-Arginin Plasmakonzentration von ~0,1-0,2mM vor41. In kultivierten Endothelzellen liegen L- Argininkonzentrationen von 0,1 bis 0,8mM und in frisch entnommenen Endothelzellen sogar Konzentrationen von 2-4 mM vor. Die Michaelis-Menten-Konstante der NOS beträgt ~3- 10µM. Dennoch ist durch extrazellulär zugeführtes L-Arginin nach Stimulation der NOS sowohl eine gesteigerte NO-Poduktion42;43, als auch ein erhöhter L-Arginin Einstrom in die Zelle auslösbar43. Ein Recycling von L-Arginin findet durch die Argininosuccinatsynthase statt, deren gemessene Bildungsrate in der Endothelzelle ~0,7-1,9 nmol L-Arginin *106 *Zellen-
1*Stunde-1 beträgt40. Aufgrund dieser Gegebenheiten wird vermutet, dass die NOS über einen eigenen lokalen L-Argininspeicher verfügt. Die Kolokalisation von eNOS, y+ (CAT-1) und Argininosuccinatsynthase innerhalb der Caveolae spricht ebenfalls dafür, dass es sich bei diesen Strukturen um eine funktionelle Einheit handelt, die auch regulativ Einfluss nimmt40;44. Bislang sind einige Regulationsmechanismen der Aminosäuretransporter auf die NOS beschrieben worden: die vasoaktiven Substanzen Bradykinin, Adenosintriphosphat (ATP)43 oder der A2-Purinoceptoragonist CGS-2186045 bewirken neben einer gesteigerten NO- Produktion einen gesteigerten L-Arginin Einstrom in die Endothelzelle als Folge einer Hyperpolarisation der Plasmamembran. Durch Versuche mittels NO-Donatoren konnte gezeigt werden, dass die NO-Freisetzung selbst akut einen steigernden Effekt auf den L- Arginintransport via y+ bewirkt, jedoch ohne eine Hyperpolarisation auszulösen, während eine längere Disposition eine inhibitorische Wirkung ausübt46;47. Diese inhibitorische Wirkung des NO wurde durch eine Oxidation der Sulfhydrylgruppen des Transporters bewirkt47.
L-Arginin stellt nicht nur das Substrat der NOS, sondern auch das Substrat der Arginase dar.
Hierbei handelt es sich um ein Enzym des Harnstoffzyklus, welches mit einer Michaelis-
Menten-Konstante von 1-3mM erheblich zum Abbau des L-Arginin beiträgt. Bislang sind zwei Isoformen der Arginase identifiziert worden: Arginase I und Arginase II. Bei Arginase I handelt es sich um ein zytosolisches Enzym, welches hauptsächlich in der Leber exprimiert wird.
Arginase II ist in den Mitochondrien lokalisiert und kommt in diversen extrahepatischen Geweben vor40. Sowohl in glatten Muskelzellen als auch in der Endothelzelle ist eine konstitutive Aktivität der Arginase beschrieben worden48. Die Arginase interagiert mit der NOS mittels Substratkonkurrenz, während das Zwischenprodukt der NO-Synthese Nω-hydroxy-L- Arginin einen potenten kompetitiven Inhibitor der Arginase darstellt (Ki 10-42µM)49.
Ein weiterer wichtiger Regulationsmechanismus für die NOS-Aktivität ist die Aktivierung durch Phosphorylierung. So führt die Aktivierung der Proteinkinase Akt zu einer Phosphorylierung der eNOS, was eine Ca2+-unabhängige Stimulation der NO-Produktion zur Folge hat 50;51. Durch Phosphorylierung verschiedener Epitope kann die NOS in ihrer Aktivität beeinflusst werden: Serin 1177 (Ser1177), Threonin 495 (Thr495), Serin 116 (Ser116) und Serin 633 (Ser633)50-52. Die Regulation der eNOS über Ser1177-Phosphorylierung wird durch die Proteinkinase A und Akt50;50;51;51, die Proteinkinase C (PKC), die AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK)53 sowie über die zyklische AMP-abhängige Proteinkinase54 modifiziert. Die eNOS ist unter basalen Bedingungen an Serin- und Threoninresten schwach phosphoryliert53. Verschiedene Stimuli, wie z.B. Scherstress, bewirken eine verstärkte Phosphorylierung an Ser1177 und damit eine Aktivierung der eNOS51-53. Die Phosphorylierung an Thr495 geht mit einer Abnahme der Enzymaktivität einher, welche in der Lokalisation in der Bindungsdomäne von CaM begründet ist53. Obwohl die Aktivierung der eNOS simultan mit Veränderungen der Phosphorylierung von Ser1177 und Thr495 einhergeht, gibt es zusätzliche Phosphorylierungswege des Enzyms: Ser116 ist in der Oxygenase-Domäne lokalisiert. Eine Phosphorylierung geht, wie auch bei Thr495, mit einer Abnahme der Enzymaktivität einher54;55. Ser633 ist an einem sogenannten Autoinhibitor-Loop, einem Peptid, welches in konstitutiv exprimierten NOS-Isoformen vorkommt, lokalisiert. Ser633 kann in vitro durch die cAMP- abhängige PKA und durch eine Proteinkinase G (PKG) phosphoryliert werden56. Bis jetzt konnte noch keine physiologische Relevanz in intakten Zellsystemen nachgewiesen werden.
In vergleichenden Studien von Ser1177 mit Ser633 wurde festgestellt, dass Ser1177 eine zentrale Rolle für die NO-Produktion spielt, wohingegen eine Phosphorylierung von Ser633 nicht detektierbar war oder konsequenzlos blieb50;50;51;51.
2.3 Metabolismus von Stickstoffmonoxid
NO ist ein farbloses Gas, welches in wässrigen Phasen bis zu Konzentrationen von 2 mM löslich ist57. Es kann durch die Reaktion mit Sauerstoff entweder zu Nitrosylanionen (NO-) reduziert oder zu Nitrosoniumionen (NO+) oxidiert werden58. Das primäre Oxidationsprodukt von NO in wässriger Lösung ist Nitrit (NO2-). Es wurde gezeigt, dass 70-90% des im Blut zirkulierenden Nitrit aus dem L-Arginin-NO-Stoffwechsel stammen und dass Nitrit als spezifischer und sensitiver Marker für akute Veränderungen der NOS-Aktivität verwendet werden kann59;60. Die Kinetik der Autoxidation von NO hängt von der Ausgangskonzentration ab61;62. Somit ist die Halbwertzeit von NO umgekehrt proportional zur NO-Konzentration und kein konstanter Wert. Im biologischen System hängt der NO-Metabolismus von der Diffusionsgeschwindigkeit über biologische Membranen sowie von der jeweiligen Konzentration an NO, Sauerstoff und anderen Reaktionspartnern ab. Die Diffusionskonstante von NO in der Gefäßwand beträgt 3300 µm2/s63. Somit diffundiert NO in kurzer Zeit durch mehrere benachbarte Zellen. Die Wirkung von NO selbst ist hiermit nicht nur auf den direkten Ort der Bildung beschränkt, vielmehr kann der parakrine Mediator deutliche Entfernungen vom Ort der Bildung bis zur Zielzelle zurücklegen. Einer der Reaktionspartner von NO während der Diffusion ist molekularer Sauerstoff. Es kommt hierbei zur Bildung höherer Stickoxide, z.B. Stickstoffdioxid und Distickstofftrioxid. Diese Stickoxide können entweder mit anderen Molekülen wie z.B. Thiolen oder Aminen reagieren oder zu Nitrit und Nitrat (NO3-) hydrolysieren. Ferner reagiert NO mit Hämproteinen und Sauerstoffradikalen. Das Ausmaß jeder dieser Reaktionen ist abhängig von den Bedingungen unter denen NO freigesetzt wird
und von der Konzentration der jeweiligen Reaktionspartner64-66. Wichtige, am Abbau von NO beteiligte Komponenten sind Superoxidanionen (O2-), Wasserstoffperoxid (H2O2) und Hydroxylradikale, die in unterschiedlichen Konzentrationen und in verschiedenen Zellen und Organen vorkommen65;67;68. Hieraus resultieren verschiedene Reaktionskinetiken von NO in vivo.
Bis vor kurzem wurde angenommen, dass endothelial gebildetes NO ausschließlich parakrin, d.h. lokal in der Gefäßwand wirkt, weil das instabile NO-Molekül abhängig von verschiedenen Faktoren nur eine Halbwertzeit von 0,05 bis 1 Sekunde aufweist. Mittlerweile gibt es jedoch Hinweise, dass die NO-Wirkung durch Speicherformen69;70 auch systemisch, bildungsortfern, also endokrin, vermittelt werden kann71-73. Im Plasma wurden NO-Intermediate gefunden, die NO reversibel binden und die es vor dem direkten Abbau schützen können. Weiterhin wurden Nitrosothiole, sogenannte RSNO72 nachgewiesen. RSNO entstehen durch die nitrosative Reaktion mit plasmatischen Thiolgruppen von Albumin, Glutathion und Cystein. Die genaue Reaktion, die zur RSNO-Bildung führt ist noch nicht geklärt. Man geht jedoch davon aus, dass die Thiolgruppen in Anwesenheit von Elektronenakzeptoren über das Nitrosylkation zu RSNO74;75 und nicht, wie lange angenommen, direkt mit NO reagieren73;76. Neben Thiolen im Plasma kann NO auch mit Aminen reagieren. Neue Befunde haben gezeigt, dass Nitrosamine (RNNO) einen physiologischen Bestandteil des humanen Plasmas darstellen und nicht nur in entzündlichen Prozessen gebildet werden. Welche Funktion RNNO übernehmen und ob auch sie NO freisetzen können, ist noch nicht geklärt.
Erythrozyten nehmen nicht alleine durch ihren großen Anteil am Blutvolumen von bis zu 50%
eine zentrale Rolle im vaskulären NO-Metabolismus ein77. Erythrozyten, primär als Sauerstofftransporter bekannt, sind zellorganellfreie Blutzellen, die lediglich durch eine Plasmamenbran vom Blutplasma abgegrenzt sind und vor allem das Protein Hämoglobin enthalten, welches ¾ der erythrozytären Proteine ausmacht. Die Erythrozyten wurden im Zusammenhang mit dem NO-Metabolismus bis vor kurzem lediglich als NO-abfangende
Zellen betrachtet, bei denen endothelial gebildetes NO durch die Reaktion mit oxygeniertem Hämoglobin bzw. durch die Bindung an deoxygeniertes Hämoglobin inaktiviert wird78;79. Erreicht endothelial gebildetes NO den Erythrozyten, so kann es mit dem Hämoglobin prinzipiell drei verschiedene Reaktionen eingehen. Einerseits kann es wie bereits beschrieben mit Oxyhämoglobin zu Methämoglobin und Nitrat reagieren. Bei der Reaktion von NO mit dem Eisen des Deoxyhämoglobins entsteht Nitrosylhämoglobin. Die dritte Reaktion ist die Bildung von S-nitroso-Hämoglobin, welches sich nach der Oxygenierung des Hämoglobins in der Lunge durch eine Nitrosierungsreaktion von NO an das Cystein-93 (Cys) der β-Kette des Hämoglobins bildet80;81. Die O2-Abgabe des Hämoglobins in der Peripherie ist mit einer Strukturänderung zur T-Form verbunden. Dies resultiert ebenfalls in der Freisetzung des an Cys-93 gebundenen NO. Sowohl S-nitroso-Methämoglobin als auch S-nitroso- Hämoglobin führen infolge der durch die Strukturänderung des Hämoglobins induzierten Instabilität und nachfolgender NO-Abspaltung zu einer Dilatation der Blutgefässe. Nitrosyl- Hämoglobin führt wie natives Hämoglobin durch Abfangen des endothelialen NO zu einer Vasokonstriktion. Wie das im Erythrozyten an Hämoglobin gebundene NO in das zellumgebende Plasma gelangt, konnte lange nicht geklärt werden. Inzwischen wird angenommen, dass ein in der Erythrozytenmembran lokalisierter AE1-Transporter (Anionenaustauscher 1-Transporter) NO über verschiedene Bindungen ins extrazelluläre Medium überführt82. Erythrozyten scheinen also nicht nur Abbauort von NO, sondern auch ein regulatorischer Bestandteil der vaskulären NO-Bioverfügbarkeit zu sein. Das im Vollblut befindliche Nitrit wurde wie oben beschrieben primär als intermediäres Zwischenprodukt im Abbau von NO betrachtet. Neueste Untersuchungen bestätigen jedoch eine ältere Hypothese, nach der auch im humanen Organismus, ähnlich der bakteriellen Nitrit-Reduktase aus Nitrit NO gebildet werden kann. Drei Mechanismen sind beschrieben: Die Xanthinoxidoreduktase83, die nicht-enzymatische Dysproportionierung oder Säure- Reduktion84;85 und die nicht-enzymatische NO-Bildung durch Deoxyhämoglobin78;86.
Das im Plasma vorliegende Nitrit wird rasch durch Oxidation mit Oxyhämoglobin zu Nitrat umgewandelt. Nitrat stellt ein stabiles Abbauprodukt von NO in vivo dar. Es bleibt im Blut bis
zu seiner Ausscheidung über die Nieren stabil und hat eine Halbwertzeit von 5-8 Stunden87;88. Der größte Anteil des intravaskulär gebildeten NO wird ebenfalls durch die Reaktion mit erythrozytärem Hämoglobin zu Nitrat umgewandelt. Die Konzentration des Nitrates im Blut wird jedoch in großem Maße von NO-Stoffwechsel-unabhängigen Faktoren beeinflusst, wie der Aufnahme durch die Nahrung, dem Metabolismus durch den Harnstoffzyklus89, der Absorption durch den Verdauungstrakt90 und der Inhalation aus der Luft91. Die in der Literatur beschriebenen basalen Konzentrationen von Nitrat differieren stark und wurden im Plasma mit 0,8-95 µmol/l92-94angegeben. Als Grund hierfür wurden bisher externe Einflußfaktoren benannt. Ein Teil des gebildeten NO entgeht der Umsetzung zu Nitrat und ist als Nitrit oder als gebundenes NO (RNO) im Plasma zu finden. Zur besseren Beurteilung des NO- Metabolismus wurde daher Nitrit als Marker für die akute eNOS-Aktivität gewählt. Es wurde gezeigt, dass dieser oxidative Metabolit durch Stimulation bzw. Inhibition in der Unterarmzirkulation des Menschen einen Marker für die akute eNOS-Aktivität darstellt95.
2.4 Einfluss von NO auf die erythrozytäre Aggregation und Verformbarkeit
Die Hämorheologie beschäftigt sich mit den Fließeigenschaften des Blutes, welche sowohl durch die zellulären Bestandteile als auch durch plasmatische Eigenschaften bestimmt werden. Da die Erythrozyten andere Blutzellen zahlenmäßig weit übertreffen, ist auf sie das Hauptaugenmerk gerichtet. Die Fließeigenschaften der Erythrozyten werden maßgeblich durch deren Anzahl im Verhältnis zum Plasma (Hämatokrit) sowie deren Verformbarkeit und Aggregierbarkeit bestimmt96;97. Als determinierende plasmatische Faktoren gelten die Konzentrationen der großen Plasmaproteine, insbesondere des Fibrinogens, aber auch der Immunglobuline, des 2-Makroglobulins98;99 und der Lipoproteine100. Während die erythrozytäre Verformbarkeit den ungestörten Blutfluss im Bereich der Mikrozirkulation
ermöglicht, gewährleistet die physiologische Aggregation die axiale Zellströmung in den Arterien und Venen, welche für den Blutfluss elementar ist96.
Unter erythrozytärer Aggregation versteht man die Zusammenlagerung der Erythrozyten zu sogenannten „Geldrollen“ (Rouleaux-Bildung), die sich mittels Interzellularbrücken der großen Plasmaproteine formen99. Es konnte gezeigt werden, dass die Aggregationsneigung zur
„Geldrollen“-Bildung mit einer zunehmenden Plasma-Fibrinogen-Konzentration ansteigt101. Aber auch andere hochmolekulare Proteine wie alpha2-Makroglobulin, der Haptoglobin- Hämoglobin-Komplex oder IgM96 und Lipide mit hohem Molekulargewicht wie LDL und VLDL haben derartige vernetzende Eigenschaften100;102-104. Die erythrozytäre Aggregation existiert bis zu einer Scherrate von 25 sec-1 oder im Extremfall sogar bis zu einer Scherrate von 100 sec-1, bei höheren Scherraten trennen sich die Erythrozyten wieder voneinander101. Eine erhöhte erythrozytäre Aggregation wird als Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen diskutiert. So konnte gezeigt werden, dass an Diabetes Mellitus105, Bluthochdruck106 oder an einer instabilen Angina pectoris107 erkrankte Personen eine erhöhte Aggregationsneigung aufweisen. Diese Erkrankungen gehen unter anderem mit einer endothelialen Dysfunktion einher1. Experimentell konnte gezeigt werden, dass eine verminderte Aggregationsneigung der Erythrozyten durch NO auslösbar ist108, während durch den NOS Inhibitor Nω-Nitro-L- Arginin Methylester (L-NAME) die erythrozytäre Aggregation gesteigert werden konnte109. Unter erythrozytärer Verformbarkeit versteht man die Elongation der Erythrozyten, die eine Passage durch die kleinsten Gefäße ermöglicht. Der Erythrozyt besitzt eine diskoide, bikonkave Form mit einem Durchmesser von ~7-8 µm beim Menschen110. Der Durchmesser der kleinsten Kapillaren mit 2-3 µm ist deutlich kleiner als der Durchmesser des Erythrozyten selbst. Eine Durchblutung im Bereich der Mikrozirkulation ist somit nur durch die Verformung des Erythrozyten möglich111.
Erythrozyt
Arteriole
Kapillare
Abb. 2.4: Schematische Darstellung der Verformung eines Erythrozyten bei der Passage durch eine Kapillare.
Die erythrozytäre Verformbarkeit ist sowohl von extrinsischen als auch intrinsischen Faktoren abhängig. Zu den extrinsischen Faktoren gehören vor allem die Scherkräfte, die auf die Oberfläche der Zellen wirken. Die Scherkraft selbst ist das Produkt aus Plasmaviskosität und Scherrate111. Intrinsische Faktoren sind die Zellgeometrie, die zytoplasmatische Viskosität, sowie die viskoelastischen Eigenschaften der Zellmembran97;111. Aus der Zellgeometrie der Erythrozyten mit ihrer diskoiden, bikonkaven Form resultiert ein vorteilhaftes Oberflächen/Volumen Verhältnis. Seine große Oberfläche ist nicht nur förderlich für den Gasaustausch zwischen Gewebe und Erythrozyt, sondern ermöglicht ihm auch, relativ große Verformungen durch einwirkende Scherkräfte zu tolerieren111;112. Die zytoplasmatische Viskosität wird hauptsächlich durch die intraerythrozytäre Hämoglobinkonzentration bestimmt111. Der dritte intrinsische Faktor, welcher die erythrozytäre Verformbarkeit im höchsten Maße beeinflusst, ist die Viskoelastizität der Zellmembran. Die Viskoelastizität der Zellmembran wird maßgeblich durch die Struktur ihres Zytoskeletts beeinflusst. Die Zellmembran besteht aus zwei Komponenten. Zum einen aus der äußeren Phospholipid- Doppelschicht. Und zum anderen aus einem Netzwerk von Strukturproteinen, welche sich an der Innenseite der Lipid-Doppelschicht befinden und in dieser verankert sind. Der Hauptanteil
dieses Netzwerks ist das Spektrin, welches aus einer α- und einer ß-Untereinheit besteht.
Dieses dimere bis auf 200% seiner Ursprungslänge dehnbare Protein113 bildet ein 200nm langes Tetramer, welches netzartig der Innenseite der Phospholipiddoppelschicht aufliegt. Im Allgemeinen sind sechs Spektrinenden mit einem Aktin (Synonym: Band 5) verbunden, welches über das Protein 4.1 und Adducin stabilisiert wird und mittels Ankyrin, Band 3 und Glycophorin C in der Phospholipiddoppelschicht verankert ist111. Aufgaben dieser Strukturproteine sind nicht nur der Erhalt der Membranstabilität, sondern vor allem die Ermöglichung der Verformung114. In diversen Studien konnte gezeigt werden, dass NO die erythrozytäre Verformbarkeit positiv beeinflusst108;115-117, während ein reverser Effekt unter Verwendung des NOS-Inhibitor L-NAME provozierbar war108;117. Eine durch L-NAME verschlechterte erythrozytäre Verformbarkeit war durch Zugabe von NO kompensierbar108.
2.5 Die erythrozytäre NO-Synthase
Erythrozyten wurden bislang ausschließlich als NO-abfangende Zellen betrachtet, welche endothelial gebildetes NO durch die Reaktion mit oxygeniertem Hämoglobin oder durch die Bindung an deoxygeniertes Hämoglobin inaktivieren (s.o.)78;79. Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass neben der Endothelzelle auch Erythrozyten eine NO-Synthase besitzen10-12;118, welche in physiologisch relevanten Mengen NO synthetisiert und exportiert10;118. Deliconstantinos et al.118 beschrieben als erste eine im Erythrozyten lokalisierte NOS. Diese NOS konnte durch oxidativen Stress und Kalzium zu einer gesteigerten NO-Produktion angeregt werden, welche durch den NOS-Inhibitor L-NMMA hemmbar war. Sie beschrieben die erythrozytäre NOS als konstitutiv exprimiert und zeigten eine Abhängigkeit von CaM, NADPH und den Kofaktoren BH4 und FAD. Mittlerweile konnte in diversen anderen Studien ebenfalls eine Kalziumabhängigkeit der erythrozytären NOS nachgewiesen werden10;11;119. Um welche NOS-Isoform es sich bei der erythrozytären NOS handelt war bis vor kurzem nicht
eindeutig geklärt. Unterschiedliche Ergebnisse, die entweder eine eNOS11 oder Kreuzreaktionen für verschiedene Isoformen beschreiben, lagen vor12;120. In Untersuchungen der eigenen Arbeitsgruppe am Modell der eNOS-Knock-Out Maus konnte die erythrozytäre NOS erstmals eindeutig als endotheliale Isoform charakterisiert werden10. Weiterhin ist die erythrozytäre NOS durch das Hormon Insulin stimulierbar10;119;121. So konnte gezeigt werden, dass die erythrozytäre NOS nach Inkubation mit Insulin sowohl eine erhöhte NO-Produktion als auch eine gesteigerte Phosphorylierung an Serin1177 aufweist, welche mit einem Phosphatidyl-Inositol-3.Kinase-Inhibitor hemmbar ist10. Am aufgereinigten NOS-Enzym aus Erythrozytenmembranen wurde gezeigt, dass das Insulin direkt mit dem Enzym eine Bindung eingeht, wodurch es vom Autor als insulin-activated-NOS (IANOS) bezeichnet wird. Die durch Insulin gesteigerte NO-Produktion war durch einen Antikörper gegen den Insulinrezeptor inhibierbar. Im Überstand der Präparation der Erythrozytenmembran zeigen Insulin und Insulinrezeptor-Antikörper keine Wirkung. Nur eine membranständige NOS kann somit durch Insulin aktiviert werden 119. In Untersuchungen der eigenen Arbeitsgruppe in mittels Gold- Labeling untersuchten Gefrierschnitten von Erythrozyten konnte gezeigt werden, dass die erythrozytäre NOS, sowohl zytosolisch als auch membranständig sein kann10. Die NO- Produktion der insulinstimulierten NOS ist durch Zugabe von Kalzium bis zu einer Konzentraion von 2mM steigerbar, eine höhere Konzentration hingegen hat eine inhibitorische Wirkung auf die NOS. NO selbst hat in einer Konzentration von unter 0,8nM eine steigernde Wirkung auf die insulinstimulierte NOS119. Weiterhin ist die erythrozytäre NOS durch ihr Substrat L-Arginin beeinflussbar. So konnte durch ein Angebot an L-Arginin eine gesteigerte erythrozytäre NO-Produktion nachgewiesen werden, welche durch Verwendung eines NOS-Inhibitors hemmbar war10;11. In Untersuchungen der eigenen Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass die NO-Produktion durch Erythrozyten konzentrationsabhängig mit steigenden L-Argininkonzentrationen zunimmt10.
Die NO-Produktion durch die erythrozytäre NOS besitzt eine inhibitorische Wirkung auf die Thrombozytenaggregation10;11.
2.6 Rosuvastatin
Die Substanz Rosuvastatin, formell als ZD4522 bekannt, stellt ein Statin der 3. Generation dar. Statine oder HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren sind cholesterinsenkende Pharmaka, welche heutzutage nicht nur weltweit bei Patienten mit Hypercholesterinämie, sondern auch bei Patienten mit KHK zum Einsatz kommen8. Die cholesterinsenkende Wirkung der Statine wurde schon 1978 erkannt. Goldstein et al.7 untersuchten die aus Penicilium ssp. isolierte Substanz Compactin122 und fanden heraus, dass diese kompetitiv die HMG-CoA-Reduktase der Cholesterinbiosynthese inhibiert7. Wenig später konnte Lovastatin, eine dem Compactin strukturell ähnelnde Substanz, aus Aspergillus spp. isoliert werden. Lovastatin wurde das erste Statin, welches pharmazeutisch zum Einsatz kam123. Die HMG-CoA-Reduktase katalysiert die Umsetzung von HMG-CoA zu Mevalonat und stellt den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Cholesterinbiosynthese dar. Statine binden mit ihrer 3,5-Dihydroxyheptansäure-Seitenkette reversibel und kompetitiv an die aktive Bindungsstelle der HMG-CoA-Reduktase124;125. Die Enzymaffinität zum Statin ist hierbei um ein vielfaches höher als zum natürlichen Substrat HMG-CoA126. Die Inhibition der Cholesterinbiosynthese der Leber hat eine gesteigerte Expression der hepatozytären LDL- Rezeptoren und somit eine Eliminierung des LDL aus dem Plasma zur Folge127. Nach einem initialen Cholesterinabfall kommt es zu einem Gleichgewicht zwischen kompensatorischen Mechanismen und HMG-CoA-Reduktase-Inhibition. Abhängig vom Statin werden reduzierte Plasma-LDL-Werte von -19% bis -60% erreicht. Bei Patienten, die an einer Hypertriglyzeridämie leiden, kommt es ebenfalls zu einem Abfall der Triglizeride um -22% bis -45%, gleichzeitig wird das HDL-Cholesterin um ~5% bis 10% erhöht8. Bei den heutzutage zum Einsatz kommenden Statinen handelt es sich entweder um rein synthetisch hergestellte Statine, wie Rosuvastatin, oder um das natürliche Produkt Lovastatin, isoliert aus Aspergillus terreus, und seine semisynthetischen Analoga. Die ersten angewandten Statine Lovastatin und Simvastatin liegen als sogenannte „Prodrugs“ vor, ihre aktive Hydroxysäure-Form wird erst in den Mukosazellen und der Leber gebildet. Alle anderen Statine liegen bereits bei Arzneimittelapplikation in ihrer aktiven Form vor. Rosuvastatin und Pravastatin sind im
Gegensatz zu den anderen Statinen nicht lipophil. Rosuvastatin stellt somit eines der wenigen Statine dar, dessen Absorption nicht von der gleichzeitigen Nahrungsaufnahme beeinflusst wird. Rosuvastatin besitzt mit 90% eine sehr hohe hepatische Extraktion und eine Bioverfügbarkeit von 75%, es besitzt eine Halbwertszeit von 11 bis 30h und eine hohe Plasma-Protein-Bindung. Gerade für einen guten lipidsenkenden Effekt ist eine hohe hepatische Extraktion von entscheidender Bedeutung. Die Metabolisierung fast aller Statine erfolgt über das Cytochrom-P450-System8. Als hypophile Substanz wird Rosuvastatin weitestgehend ohne Metabolismus über das Cytochrom-P450-System über die Faeces ausgeschieden128. Statine sind im Allgemeinen gut verträgliche Arzneimittel. Als ernstzunehmende Nebenwirkungen können Myalgien und sehr selten auch Rhabdomyolysen auftreten8. Mevalonat stellt nicht nur den Grundbaustein des Cholesterins dar, sondern es gewährleistet auch die Bereitstellung verschiedener Intermediärprodukte der Cholesterinbiosynthese, welche z.B. für die Synthese der Isoprenoide benötigt werden129;130. Diese Intermediärprodukte sind u.a. entscheidend für die Zellfunktion der quergestreiften Muskulatur8. Als Folge einer Zerstörung des Sarkolemm können kurzzeitig nach Therapiebeginn erhöhte Plasma-Kreatininkinase- und Myoglobinwerte auftreten. Verstärkte Nebenwirkungen treten auch aufgrund von Arzneimittelinteraktionen auf. Arzneimittel, deren Metabolisierung ebenfalls über das Cytochrom-P450-System abläuft, verursachen eine vermehrte Anhäufung der lipophilen Statine im Organismus8;131. Für das hydrophile Rosuvastatin besteht dieses Risiko nicht128;132
N N F
N
CH3
CH3
CH3
S
O O
O O-
H3C
OH O HO
O- O HO
S-CoA H3C
HMG-CoA Rosuvastatin
Abb.2.6: Strukturformel des HMG-CoA und des HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor Rosuvastatin.
Neben ihrer cholesterinsenkenden Wirkung besitzen Statine noch diverse andere vasoprotektive Eigenschaften. Diese pleiotropen Effekte sind neben der HMG-CoA- Reduktase-Hemmung für den therapeutischen Nutzen der Statine von großer Bedeutung. So konnte gezeigt werden, dass die Einnahme von Statinen das Herzinfarktrisiko unabhängig von einer Abnahme des LDL-Cholesterins senkt133. Statine steigern eine durch Acetylcholin provozierte Vasodilatation und verbessern somit die Endothelfunktion134. Sie üben einen inhibitorischen Effekt auf Metalloproteinasen aus, erhöhen den Kollagenanteil in atherosklerotischen Plaques und beugen somit der Plaqueruptur vor135. Dieser Effekt wird weiterhin begünstigt durch eine Inhibition der Oxidation des LDL-Cholesterins136;137, eine Inhibition der Cholesterinaufnahme der Makrophagen137, sowie eine verminderte Adhäsionsneigung der Monozyen an die Gefäßwand138. Eine verminderte
Thromboxanbiosynthese resultiert in einer gesenkten Aggregationsneigung der Thrombozyten139 und einer gesteigerten Biosynthese des Plasminogen Aktivators, zudem führt eine verminderte Aktivität des Plasminogen Activator Inhibitor-1 zu einer verbesserten Fibrolyse140-142. Weiterhin wirken Statine entzündungshemmend. So sinkt nach Statintherapie der plasmatische Anteil des C-reaktiven Proteins (CRP). Hierbei handelt es sich um einen Entzündungsmarker, welcher positiv mit dem KHK-Risiko korreliert143;144. Indirekt erhöhen Statine die NO-Bioverfügbarkeit, indem sie die Bildung reaktiver Sauerstoffradikale (ROS) unterdrücken und somit den Verlust an vasoaktivem NO durch die Reaktion mit ROS verhindern145;146.
Viele dieser Effekte können ganz oder teilweise auf eine eNOS Aktivierung zurückgeführt werden1. Statine stabilisieren die eNOS mRNA und steigern somit posttranskriptional die eNOS Expression 147. Es konnte gezeigt werden, dass Statine die hypoxie-induzierte Herunterregulation der eNOS in kultivierten ECs verhindern148. Verursacht wird dies durch einen Mangel bestimmter Zwischenprodukte der Cholersterinbiosynthese.
Intermediärprodukte der Cholesterinbiosynthese wie Farnesylpyrophosphat (FPP) oder Geranylgeranylpyrophosphat (GGPP) spielen eine wichtige Rolle in der posttranslationalen Modifikation einer Vielzahl von Signalproteinen. Rho ist ein Guanosinotriphosphat (GTP)- bindendes Protein, welches zwischen einem aktiven GTP-bindenden und einem inaktiven Guanosinodiphosphat (GDP)-bindenden Zustand pendelt, während es von der Plasmamembran ins Zytoplasma transloziert. Die Geranylgeranylierung des Rho ist eine Grundvoraussetzung für seine Translokation149. Statine verhindern die Geranylgeranylierung und hemmen somit die Rho-GTPase, wodurch eine stabilisierende Wirkung auf die mRNA der eNOS ausgeübt wird150. Caveolin-1 inhibiert direkt die Aktivität der NOS151. Es konnte gezeigt werden, dass Atorvastatin die Expression von Caveolin-1 senkt und somit eine deutliche Steigerung der NOS-Aktivität und NO-Produktion bewirkt152. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Statine die eNOS auch direkt mittels Phosphorylierung durch die Serin/Threoninkinase Akt (Synonym: Proteinkinase B) aktivieren153. Für eine Aktivierung durch die Akt wird das Hitzeschockprotein 90 (hsp90) benötigt154. Die M-Domäne des hsp90
interagiert mit dem N-terminalen Ende der eNOS und der Akt155. Eine gesteigerte Interaktion der Proteinkinase B und dem hsp90, mit der eNOS nach Verabreichung von Atorvastatin konnte gezeigt werden152;154.
3 Zielsetzung
Es konnte gezeigt werden, dass neben der Endothelzelle auch rote Blutzellen eine NO- Synthase besitzen118. Erst kürzlich konnte diese NO-Synthase eindeutig als endotheliale Isoform charakterisiert werden10. Ob und wie eine pharmakologische Beeinflussung dieser erythrozytären eNOS möglich ist, ist bislang ungeklärt. Statine sind cholesterinsenkende Pharmaka, welche in der Lage sind, direkt endotheliale NO-Synthasen zu aktivieren153. Über eine Aktivierung der erythrozytären NOS durch Statine ist bislang jedoch nichts bekannt. In der vorliegenden Arbeit soll untersucht werden, ob der HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor Rosuvastatin eine Wirkung auf die Aktivität der erythrozytären NOS ausübt. Als NO- vermittelte rheologische Folgeerscheinungen soll die Wirkung des Rosuvastatin auf die erythrozytäre Aggregation und Verformbarkeit untersucht werden. Dies soll sowohl ex vivo in Vollblutproben von Probanden, als auch nach Verabreichung von Rosuvastatin beim Hund untersucht werden.
Die plasmatische Nitritkonzentration stellt einen Marker der NO-Bildung durch endotheliale NO-Synthasen dar95 und soll in dieser Arbeit als Parameter der Aktivität der erythrozytären NOS ex vivo dienen. Die gleichzeitige Anwendung eines spezifischen NOS-Inhibitor und Rosuvastatin soll zur Prüfung der Spezifität der NO-Bildung durch die erythrozytäre NOS eingesetzt werden. Eine akute Aktivierung endothelialer NO-Synthasen durch Statine findet mittels Phosphorylierung der Akt an Serin1177 statt153. Erst kürzlich konnte gezeigt werden, dass eine Aktivierung der erythrozytären NOS durch Insulin mittels Phosphorylierung an Serin1177 abläuft10. Ob eine mögliche Aktivierung der erythrozytären NOS durch Statine ebenfalls mit einer Phosphorylierung an Serin1177 einhergeht, ist bislang nicht bekannt.
Da in vivo die NO-Bildung und somit auch die Nitritbildung nicht nur durch die erythrozytäre NOS sondern vor allem auch durch die eNOS der Endothelzelle verursacht wird10;95, ist eine Bestimmung der Aktivität der erythrozytären NOS mittels der plasmatischen Nitritkonzentration im Tierversuch nicht möglich. Ein Inkubationsassay soll entwickelt werden und somit eine gezielte Untersuchung der Aktivität der erythrozytären NOS im Tierversuch ermöglichen.
Zusammenfassung der Ziele und Fragestellungen:
1. Bewirkt Rosuvastatin eine Aktivierung der erythrozytären NOS ex vivo in humanen Vollblutproben?
a. Untersuchung der NO-Produktion
b. Untersuchung der NO-Produktion bei gleichzeitiger NOS-Inhibition c. Untersuchung der eNOS-Phosphorylierung an Serin1177 in Erythrozyten
2. Verändert Rosuvastatin die Hämorheologie ex vivo in humanen Vollblutproben?
a. Messung der erythrozytären Aggregation b. Messung der erythrozytären Verformbarkeit
3. Etablierung eines Inkubationsassays zur Bestimmung der Aktivität der erythrozytären NOS im Tierversuch beim Hund.
4. Bewirkt die Verabreichung von Rosuvastatin eine Aktivierung der erythrozytären NOS beim Hund?
a. Messung mittels Inkubationsassay
5. Verändert die Verabreichung von Rosuvastatin die Hämorheologie beim Hund?
a. Messung der erythrozytären Aggregation b. Messung der erythrozytären Verformbarkeit
4 Material und Methoden
4.1 Material
4.1.1 Vollblutproben von gesunden Probanden
Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen wurde Vollblut von weiblichen und männlichen gesunden Personen mittleren Alters (20-40 Jahre) verwendet, welche sich freiwillig für die Blutabnahme zur Verfügung stellten. Keiner der Probanden litt an Bluthochdruck, Diabetes mellitus oder einer erblich bedingten Hypercholesterinämie. Keiner der Probanden hatte innerhalb der letzten zwei Wochen ein Arzneimittel eingenommen (Ausnahme: Konzeptivum bei weiblichen Probanden).
4.1.2 Vollblutproben von gesunden Hündinnen
Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen wurde Vollblut von vier gesunden ausgewachsenen Hündinnen der Rasse Foxhound (Herkunft: Zentrales Tierlabor, Universitätsklinikum Heidelberg) sowie von zwei ausgewachsenen gesunden Schäferhundmischlingshündinnen (Herkunft: Versuchstierzuchtanstalt Bonengel, Schweinfurt) verwendet. Die Hunde waren im Zentralen Tierlabor des Universitätsklinikum Essen untergebracht. Versuchsleiter war Prof. Dr. med. R. Schulz aus dem Institut für Pathophysiologie, Zentrum für Innere Medizin. Jeder Hund war in einem 6,2m2 oder 7m2 großen Zwinger mit Liegemöglichkeit untergebracht und erhielt vormittags entweder einzeln oder in Gesellschaft für ~4-6h Stunden Auslauf in einem 35,34m2 oder 70,68m2 großen Indoorgehege mit verschiedenen Spiel- und Klettermöglichkeiten. In einem Raum befanden sich mehrere Zwinger. Die Hunde waren durch großmaschige Metallgitter voneinander getrennt, so dass Sozialkontakte untereinander möglich waren. Die Hunde erhielten täglich
zwischen 13:30 und 14:00 Uhr eine Standarddiät (ssniff® Hd-H, Exdrudat, ssniff Spezialitäten GmbH, Soest). Wasser wurde über den Tag mittels Tränkschale ad libitum gereicht. Die Zwinger und Ausläufe wurden täglich feucht gereinigt. Die klimatisierten Räume wiesen eine konstante Temperatur von 21°C und eine Luftfeuchtigkeit von 55±5% auf. Mittels Lichtprogramm wurden die Räume von 7:00 Uhr bis 19:00 Uhr erleuchtet. Intensiver Tierpflegerkontakt war Grundvoraussetzung für das Wohlbefinden der Hunde, sowie ein gutes Handling bei den Blutabnahmen. Bei Ankunft besaßen die Foxhounds ein Körpergewicht von durchschnittlich 46,8kg und die Schäferhundmischlinge von 27,1kg. Zum Zeitpunkt des Versuches war bei den Foxhounds ein Körpergewicht von 37,1kg und bei den Schäferhundmischlingen von 32,0kg messbar. Sie besaßen ein Alter von 3-4 Jahren (Schäferhundmischlinge) und 8-9 Jahren (Foxhounds). Das Geschlecht war aufgrund besserer Erfahrungen im Handling mit weiblichen Tieren festgelegt worden. Der Gesundheitszustand wurde sowohl adspektorisch als auch durch ein gleichzeitig erhobenes rotes und weißes Blutbild vor jeder Messung überprüft. Alle Hunde hatten innerhalb der letzten drei Wochen vor der Blutabnahme keine anderen Arzneimittel erhalten. Zwischen den Blutabnahmen wurde ein Zeitraum von zwei Wochen zur Erholung der Tiere eingehalten.
Zum Zeitpunkt der Blutabnahme zeigten die Hunde keine Läufigkeitssymptome.
4.1.3 Übersicht über die verwendeten Proben
Spezies Anzahl Art der Proben Herkunft
Mensch 50 Blutproben Freiwillige Probanden
Hund 24 Blutproben
Institut für Pathophysiologie, Zentrum für Innere Medizin, Universitätsklinikum Essen
4.1.4 Verwendete Substanzen und Reagenzien für die Vollblutinkubation
Substanz Bezugsquelle L-Arginin Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland
L-Valin Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland
N5-(1-Iminoethyl)-L-Ornithin (L-NIO) Alexis Corporation, Lausen, Schweiz NG-Monomethyl-L-Arginin (L-NMMA) Alexis Corporation, Lausen, Schweiz S-Ethyl-N-{4(Trifluoromethyl)
Phenyl}Isothiourea (ETU)
Alexis Corporation, Lausen, Schweiz
NG, NG-Dimethyl-L-Arginin (ADMA) Alexis Corporation, Lausen, Schweiz
Insulin Actrapid, Novonordisk Bagsvaerd, Dänemark
Calzium-Ionophore Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland
EDTA Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland
Rosuvastatin AstraZeneca, Macclesfield, Chestire, UK PBS-Puffer pH 7,3 Serag-Wiessner GmbH, Naila, Deutschland Refludan (Lepirudin) Schering, Berlin, Deutschland
4.1.5 Verwendete Substanzen und Reagenzien für die Nitritmessung mittels reduktiver Chemilumineszenz- detektion
Substanz Bezugsquelle Kaliumiodid Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Iodine Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland LiChrosolv Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Essigsäure Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Natriumhydroxid Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland Aceton Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland Isopropanol Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Aqua B. Braun B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland Natriumnitrit Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Helium Linde, Unterschleißheim, Deutschland
4.1.6 Verwendete Substanzen und Reagenzien für die Nitratmessung mittels Fluß-Injektions-Analyse
Substanz Bezugsquelle
Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid- Phosphat (NADPH)
Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland
Glukose-6-Phosphat Roche Life Sciences, Mannheim, Deutschland
Glucose-6-Phophat-Dehydrogenase Roche Life Sciences, Mannheim, Deutschland
TRIS-HCl BioRad, Kalifornien, USA
Aqua ad injectabilia B.Braun, Melsungen AG, Deutschland Nitratreduktase Roche Life Sciences, Mannheim,
Deutschland
Aqua B. Braun B.Braun, Melsungen AG, Deutschland PBS-Puffer pH 7,3 Serag-Wiessner GmbH, Naila, Deutschland Natriumnitrat Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland N-(1-Naphtyl)ethylendiamine
Dihydrochloride
Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz
Sulfanilamid Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Isopropanol Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Salzsäure Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
LiChrosolv Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
4.1.7 Verwendete Substanzen und Reagenzien für die modifizierte Filtrationsmethode
Substanz Bezugsquelle
PBS-Puffer pH 7,3 Serag-Wiessner GmbH, Naila, Deutschland Lepirudin Schering, Berlin, Deutschland
4.1.8 Verwendete Substanzen und Reagenzien für den
immunhistochemischen Nachweis der phosphorylierten Form der eNOS
Substanz Bezugsquelle
PBS-Puffer pH 7,3 Serag-Wiessner GmbH, Naila, Deutschland
Methanol Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Paraformaldehyd Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland
Triton-X-100 neoLab, Heidelberg, Deutschland
Tris-Base Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland
Tween 20 BioRad Laboratories, 2000 Alfred Nobel Dr., Hercules, CA 94 547
Trypsin Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Hydrogenperoxid Sigma-Aldrich GmbH, München, Deutschland Blotting Grade Blocker, Non-fat dry
milk
BioRad Laboratories, 2000 Alfred Nobel Dr., Hercules, CA 94 547
PeNOS Antikörper (Ser1177) Upstate, Lake Placid, NY
goat antirabbit antibody Dako, Glostrup, Denmark streptavidin–horseradish-peroxidase
conjugate
Amersham, Little Chalfont, England
4.1.9 Verwendete Substanzen und Reagenzien zur Messung des Blut-pH Wertes
Substanz Bezugsquelle
Puffer pH 7,00 Riedel-de Haën, RdH Laborchemikalien, Seelze, Deutschland Puffer pH 9,00 Riedel-de Haën, RdH Laborchemikalien, Seelze, Deutschland Aqua B. Braun B.Braun, Melsungen AG, Deutschland
4.2 Material und Geräte
4.2.1 Materialien zur Gewinnung von Vollblutproben
Material Bezugsquelle Punktionskanüle Venofix, 0,8mm, B.Braun Melsungen AG,
Melsungen, Deutschland
Sterile Einmalspritze 10ml BD Becton Dickinson, Heidelberg , Deutschland
Reaktionsgefäß Greiner bio one, Frickenhausen Deutschland
Venenverweilkanüle KLINIKA MedicalGmbH, Usingen,
Deutschland
Stauschlauch Prämeta, Deutschland
Tupfer Fuhrmann Verbandstoffe GmbH, Much,
Deutschland
4.2.2 Materialien für die Vollblutinkubation
Material Bezugsquelle
Warmwasserbad GFL, Deutschland
Externes Thermometer Brand, Deutschland
Reaktionsgefäße (50ml/15ml) Greiner bio one, Frickenhausen, Deutschland
Eppendorf-Reaktionsgefäße Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland Eppi-Schwimmer Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland