Quantitative bakteriologische Untersuchung

An den Tagen 2, 11 und 17 nach erfolgter experimenteller Infektion wurden zusätzlich auf steriler Oberfläche abgesetzte, individuelle Exkrementeproben von den drei infizierten Tieren (Seeder birds) zum quantitativen Nachweis gewonnen. Am Ende aller drei Durchgänge der Hauptversuche erfolgte die quantitative bakteriologische Untersuchung von Campylobacter jejuni im Caecuminhalt jedes Tieres.

Für die quantitative bakteriologische Untersuchung wurde ohne vorangestellte Anreicherung zunächst eine Erstverdünnung (0,5 g Probenmaterial in 4,5 ml sterile Phosphatgepufferte Salzlösung, PBS) vorgenommen. Im Anschluss wurden weitere Dezimalverdünnungen bis 10^-9 angefertigt. Mit jeder erfolgten Verdünnung oder Überführung der Probe wurden diese mit Hilfe eines Vortexmischers gründlich durchmischt. 0,1 ml aus jeder Dezimalverdünnung wurden nach dem Spatelverfahren im Doppelansatz auf die Oberfläche eines mCCD-Agars aufgetropft und mit einem Spatel verteilt. Nach einer Bebrütung in mikroaerober Atmosphäre für 44 h ±4 h bei 41,5 °C wurden die gewachsenen Kolonien ausgezählt und ein Mittelwert aus den beiden Doppelansätzen gebildet. Es wurden lediglich Platten berücksichtigt auf denen 30 bis 300 Kolonien gewachsen waren. Die Anzahl der KbE/g Probe wurde nach folgender Formel ermittelt (ISO 2006):

𝑁 = ∑ 𝛼

V × [𝑛1 + (0,1 × 𝑛2)] × d

𝑁 = KbE/g

∑ 𝛼 = Summe aller Kolonien der Agarplatten, auf denen mindestens 30 und höchstens 300 gezählt wurden

𝑉 = Volumen der Infektionssuspension in ml, welche auf eine Agar-Platte aufgebracht wurde

𝑛1 = Anzahl der Platten der ersten (niedrigsten) auswertbaren Verdünnungsstufe 𝑛2 = Anzahl der Platten der zweiten (nächst höheren) auswertbaren Verdünnungsstufe 𝑑 = Verdünnungsfaktor der ersten (niedrigsten) auswertbaren Verdünnungsstufe 3.8.2.3 Weitere bakteriologische Untersuchungen

Die qualitative bakteriologische Untersuchung auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von Salmonellen in der Einstreu erfolgte am Ende der Versuchsphase mit Ausstallung der Tiere.

Hierzu wurden aus jeder Untergruppe 25 g Einstreu mit 225 ml Peptonwasser versetzt und für 24 h bei 37 °C inkubiert. Im Anschluss wurde jeweils 1 ml der Einstreususpension in die Selektivanreicherungsmedien Rappaport-Vassiliadis (RV)-Anreicherungslösung und Tetrathionat-Brillantgrün-Galle Bouillon überführt und im Brutschrank bei 42 °C für 24 h

stehen gelassen. Nach gründlicher Durchmischung wurden die Anreicherungen mittels steriler Impföse auf die Selektivnährböden Brilliance™ Salmonella Agar und Brilliantgrün-Phenolrot-Laktose-Saccharose Agar übertragen und bei 37 °C über 24 h bebrütet. Im Anschluss wurden die Nährböden auf verdächtige Kolonien untersucht.

Sektionsablauf 3.9

In den Hauptversuchen fand 21 Tage nach künstlicher Infektion eine Sektion aller Tiere statt. Um über die Dauer der Sektion in gleichmäßiger Weise Tiere aus den Gruppen zu entfernen und möglichst wenig Zeit von der Tötung eines Tieres bis zur Inkubation der Proben seines Caecuminhaltes verstreichen zu lassen, wurde jeweils ausschließlich ein Tier aus jeder Futtergruppe gegriffen. Diese zufällig ausgewählten Tiere durchliefen die einzelnen Sektionsschritte gemeinsam und stellten so eine Sektionsrunde dar. Je nach der Anzahl der zur Sektion anstehenden Übergruppen formten entweder zwei oder vier Tiere eine Sektionsrunde. Die Tötung der Tiere erfolgte nach Betäubung mittels gezieltem Genickschlags durch Blutentzug nach Durchtrennung der V. jugularis bzw. A. carotis communis im kaudoventralen Bereich der Wangenlappen. Nach erfolgter Tötung wurde die Fußballengesundheit individuell beurteilt (Bewertungsschlüssel ist Kapitel 3.6.1 zu entnehmen) und die Tiere eröffnet. Die Eröffnung erfolgte durch ein Umschneiden der Kloake. Der Magen-Darm-Trakt wurde anschließend durch die entstandene Öffnung vorsichtig entfernt. Bevor eine Probenentnahme stattfand wurde jedes Tier auf pathologische Veränderungen in der Leibeshöhle geprüft. Das Caecum wurde aufgesucht und vom restlichen Magen-Darm-Trakt abgetrennt. Der Caecuminhalt wurde unter Einhaltung steriler Bedingungen in ein Gefäß ausgestrichen, sodass unmittelbar im Anschluss 0,5 g mit einer Impföse entnommen und in ein steriles Röhrchen (Röhre 13 ml, Sarstedt AG & Co., Nümbrecht) überführt werden konnten. In diesem waren bereits 4,5 ml PBS vorgelegt. Diese Verdünnung stellte die Erstverdünnung weiterer sich anschließender Dezimalverdünnungen dar. Das methodische Vorgehen zur quantitativen bakteriologischen Untersuchung von Campylobacter jejuni ist in Kapitel 3.8.2.2 dargestellt. Zwischen jedem Tier wurde die Arbeitsumgebung gereinigt und desinfiziert, die Handschuhe und das Sektionsbesteck gewechselt, um erneute sterile Verhältnisse zu schaffen. Im Anschluss an

die Sektion der Tiere aus den infizierten Gruppen, wurde ebenfalls der Caecuminhalt der fünf Sentinel qualitativ auf das Vorhandensein von Campylobacter jejuni untersucht.

Tiergesundheit 3.10

Die Tiere wurden mehrmals täglich auf ihr arttypisches Verhalten und Allgemeinbefinden untersucht. Die Gewichtskontrollen und individuellen Probennahmen ließen eine regelmäßige Einzeltieruntersuchung zu. Tiere mit gestörtem Allgemeinbefinden (z.B.

Abweichungen vom arttypischen Verhalten, der physiologischen Körperhaltung oder dem Ernährungsszustand) wurden aus der Gruppe entfernt und einer entsprechenden Behandlung zugeführt. Traten solche Tiere während der Versuchsphase auf wurden sie durch Tiere aus einer Reservegruppe ersetzt. Alle Tiere, die ohne offensichtlichen Grund verstarben wurden in der Klinik für Geflügel der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover seziert und abweichende Befunde erhoben.

Alle Tiere wurden entsprechend der Verordnung zum Schutz gegen die Geflügelpest und die Newcastle-Krankheit (Geflügelpest-Verordnung) §7 Abs. 1⁹ gegen die anzeigepflichtige Newcastle Disease geimpft. Die Impfung erfolgte innerhalb der Aufzuchtphase 2 mit dem Lebendimpfstoff Nobilis ® ND Clone 30 (Intervet Deutschland GmbH, Unterschleißheim). Im Fall des längeren Verbleibs in dieser Aufzuchtphase (Linie Lohmann Brown-Classic (A2) wurde die Impfung in einem Rhythmus von sechs Wochen wiederholt. Unter den experimentell mit Campylobacter jejuni infizierten Tieren konnte kein gestörtes Allgemeinbefinden festgestellt werden.

9 Vgl. Geflügelpest-Verordnung, BGBl. I Nr.57, S. 2748

Statistische Auswertung 3.11

Die Ergebnisse wurden mit Hilfe von Excel 2010 (Fa. Microsoft Corp., USA) in Tabellen und Diagrammen dargestellt. Die statistische Auswertung der gesammelten Daten erfolgte mit einem Statistical Analysis System für Windows, dem SAS® Enterprise Guide®, Version 7.1 (SAS Institute Inc. Cary, USA).

Die erhobenen Leistungsdaten aus den Vorversuchen wurden im Fall normaler Verteilung mittels 1-faktorieller Varianzanalyse und im Fall nicht normal verteilter Daten mit Hilfe nicht-parametrischer Verfahren (Kruskal-Wallis-Test oder Wilcoxon-Two-Sample-Test) verglichen. Auch der Gruppenvergleich im Hinblick auf die Laurinsäurekonzentrationen im Chymus erfolgte mittels 1-faktorieller Varianzanalyse getrennt nach den Darmabschnitten.

Varianzanalysen für Messwertwiederholungen („repeated measurements“) wurden genutzt, um die analysierten Werte im Verlauf des Magen-Darm-Traktes zu bewerten. Die Ergebnisse der Leistungsdaten und Einstreuproben in den Hauptversuchen und der Campylobacter-Last im Caecum wurden hinsichtlich zweier Einflussfaktoren Linie und Futter bzw. Alter und Futter mit Hilfe einer 2-faktoriellen Varianzanalyse in unabhängiger Weise und gemeinsamer Wechselwirkung getestet. Für die statistische Auswertung der Camplyobacter-Zahl wurden diese zuvor logarithmiert. Die Bewertung der qualitativen Zielgrößen erfolgte, nach einer Kodierung in die dichotomen Variablen 1 für Camyplobacter positiv und 0 für Campylobacter negativ, mit dem Chi-Quadrat-Homogenitätstest nach Pearson bzw. bei geringen Häufigkeiten mit dem Test nach R.A.

Fisher. Die Ergebnisse der Fußballenveränderungen wurden ebenfalls nach diesem Testverfahren bewertet. Der mögliche Einfluss des Futters bzw. der Linie auf die Campylobacter-Zahl in den Exkrementen der Seeder birds wurde zunächst mittels 1-faktorieller Varianzanalyse für die drei verschiedenen Messzeitpunkte einzeln bestimmt und im Anschluss mit Hilfe der Varianzanalysen für Messwertwiederholungen („repeated measurements“) der Einfluss der Zeit auf die Messwerte bewertet. Die durchgeführten Tests erfolgten zu einem vergleichsbezogenen Niveau von 𝛼 = 5 %. Eine Korrelationsanalyse zwischen quantitativen Merkmalen wurde durch die Ermittlung des Korrelationskoeffizienten nach Pearson durchgeführt. In den Tabellen des folgenden Kapitels 4 Ergebnisse werden die Mittelwerte, die signifikant unterschiedlich zueinander sind, mit unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnet.

Ergebnisse 4

Die Darstellung der Ergebnisse orientiert sich an dem Aufbau des Kapitels Material und Methoden und beginnt mit den Ergebnissen aus den Untersuchungen der verwendeten Futtermittel, gefolgt von der Darlegung der Ergebnisse aus den Vorversuchen.

Anschließend folgen die Ausführungen zu den Untersuchungsergebnissen der Hauptversuche beginnend mit den zootechnischen Leistungsparametern über die Ergebnisse aus den bakteriologischen Untersuchungen bis abschließend die erhobenen Daten zu den Einstreuproben und der Fußballengesundheit betrachtet werden.

Chemische Zusammensetzung der analysierten Futtermittel 4.1

Ziel war es, für alle Durchgänge isoenergetische Futter mit gleicher Zusammensetzung der Nährstoff-, Mineralstoff- und Aminosäuregehalte herzustellen. Durch Verwendung desselben kommerziell hergestellten Ausgangsfutters waren keine Unterschiede hinsichtlich dieser Parameter zu erwarten. Von zentralem Interesse waren die Fett- und Energiegehalte, sowie das Fettsäuremuster der Kontroll- und Versuchsfuttermittel, da dem Ausgangsfutter im Institut für Tierernährung je nach Durchgang unterschiedliche Futterfette in identischer Konzentration zugesetzt wurden (siehe Kapitel 3.3). In Tabelle 8 und Tabelle 11 werden die analysierten Nährstoff-, Mineralstoff- und Aminosäuregehalte der Kontroll- und Versuchsfutter aus den Vor- und Hauptversuchen aufgezeigt. In Tabelle 9 und Tabelle 12 werden die berechneten Energiegehalte der einzelnen Futtermittel aus den Vor- und Hauptversuchen dargestellt. Zusätzlich wurden die Rfe-Gehalte und das Fettsäuremuster der verwendeten Futterfette in den Hauptversuchen vor ihrer Zugabe zu den Futtermitteln aufgeführt (siehe Tabelle 10).

Tabelle 8: Analysierte Nährstoff-, Mineralstoff- und Aminosäuregehalte der Kontroll- und Versuchsfutter in den Vorversuchen (Angaben in g/kg TS)

Durchgang 1 2

In den Vorversuchen war von Durchgang 1 auf Durchgang 2 ein Anstieg des Rfe-Gehalts um annähernd 3 % zu sehen (siehe Tabelle 8), der die Erhöhung der Zugabe der Futterfette zum Ausgangsfutter von 2 % im ersten Durchgang auf 5 % im zweiten Durchgang widerspiegelt. Analog zu dieser Erhöhung im Rfe-Gehalt kam es auch zu einer Erhöhung des Energiegehalts im Futter, wie in Tabelle 9 zu sehen ist.

Tabelle 9: Berechnete Energiegehalte der Kontroll- und Versuchsfutter in den Vorversuchen (Angaben in MJ/kg TS)

Die Rfe-Gehalte in den Futtermitteln des zweiten Vorversuchsdurchgangs unterschieden sich deutlich, sodass sich auch die Energiegehalte der Kontroll- und Versuchsfutter innerhalb eines Durchgangs unterschieden (im zweiten Durchgang um 0,3 MJ ME/kg TS).

Tabelle 10: Analysierte Rfe-Gehalte und Summe der Gehalte der Fettsäuren in den Futterfetten der Hauptversuche (Angaben in g/Probe)

Futterfett Kontrollfett Versuchsfett

Rfe 955 812

Summe der Fettsäuren C4:0 bis C24:0 970 966

Wie in Tabelle 10 zu sehen, lag der Rfe-Gehalt/g des Kontrollfetts 143 g über dem Rfe-Gehalt der Palmkernfettsäuren. In der Summe ergaben die Gehalte der Fettsäuren dieser Futterfette jedoch vergleichbare Werte. Die Gehalte der einzelnen Fettsäuren C4:0 bis C24:0 in den Futterfetten können dem Anhang entnommen werden (siehe Tabelle 63).

Die Unterschiede im Rfe-Gehalt der Futterfette spiegelten sich infolge ihrer Zugabe in den Rfe-Gehalten der Futtermittel wider. Die bereits in der Analyse der Rfe-Gehalte in den Futtermitteln des zweiten Vorversuchsdurchgangs gezeigten Unterschiede ließen sich ebenfalls in den Hauptversuchen erkennen. Der Rfe-Gehalt im Versuchsfutter der Hauptversuche war stets niedriger als der Rfe-Gehalt im Kontrollfutter (siehe Tabelle 11).

Tabelle 11: Analysierte Nährstoff-, Mineralstoff- und Aminosäuregehalte der Kontroll- und Versuchsfutter in den Hauptversuchen (Angaben in g/kg TS)

Durchgang 1 2 3

Die Energiegehalte der Kontroll- und Versuchsfutter innerhalb eines Durchgangs der Hauptversuche unterschieden sich im ersten Durchgang um lediglich 0,1 MJ ME/kg TS, im zweiten um 0,4 MJ ME/kg TS und im dritten um 0,5 MJ ME/kg TS (siehe Tabelle 12).

Tabelle 12: Berechnete Energiegehalte der Kontroll- und Versuchsfutter in den Hauptversuchen (Angaben in MJ/kg TS)

Im ersten Durchgang der Vorversuche waren im Versuchsfutter 2 geringere Mengen Laurinsäure (Versuchsfutter 1:10,4 g/kg TS; Versuchsfutter 2: 9,26 g/kg TS) und höhere Mengen Capryl- und Caprinsäure im Vergleich zum Versuchsfutter 1 enthalten (siehe

Tabelle 13). Die Zugabe von 5 % Futterfett im zweiten Durchgang anstelle der Zugabe von 2 % Futterfett im ersten Durchgang der Vorversuche, wie in Tabelle 13 zu sehen, resultierte in einer Erhöhung der Laurinsäuregehalte um das 2,3-fache (Versuchsfutter 1 in Durchgang 1:10,4 g/kg TS; Versuchsfutter in Durchgang 2: 24,0 g/kg TS).

Tabelle 13: Gehalte ausgewählter Fettsäuren der verwendeten Futtermittel in den Vorversuchen (Angaben in g/kg TS) Hauptversuche konstante Gehalte der Laurinsäure im Versuchsfutter hergestellt werden.

Die Analyse der Laurinsäuregehalte im Versuchsfutter ergab im Mittel das 42,8-fache der Gehalte im Kontrollfutter.

Tabelle 14: Gehalte ausgewählter Fettsäuren der verwendeten Futtermittel in den Hauptversuchen (Angaben in g/kg TS)

Ergebnisse der Vorversuche 4.2

Im Folgenden werden die für die Hauptversuche relevanten Ergebnisse aus den Vorversuchen dargestellt. Die Darlegung erfolgt unterteilt in die Durchgänge 1, 2 und 3.

Durchgang 1 4.2.1

Die Darstellung der Ergebnisse aus Durchgang 1 der Vorversuche erfolgt im Hinblick auf die zootechnischen Leistungsparameter der Linie Ross 708 während der Fütterungsphase Mast II (d28-0) nach Gabe der für die Hauptversuche in Betracht kommenden Futtermittel.

Die Gruppen, die das Kontrollfutter erhielten, zeigen bzgl. der Futteraufnahme (3871 g ±47,2) signifikante Unterschiede zu den Gruppen, denen das Versuchsfutter 1 gefüttert wurde (3698 g ±48,4). Die Futteraufnahme der Gruppen, die das Versuchsfutter 2 erhielten, unterschied sich weder von den Gruppen, denen das Kontrollfutter angeboten wurde, noch von den Gruppen, denen das Versuchsfutter 1 gereicht wurde.

Die erhobenen Daten zur Körpermasse an Tag 0 (= Tag der Sektion; entspricht Lebenstag 43) zeigten signifikante Abweichungen zwischen den Gruppen, die das Kontrollfutter erhielten (2828 g ±33,1), und den Gruppen, denen das Versuchsfutter 1 gefüttert wurde (2761 g ±28,1). Die Körpermassen der Gruppen, die das Versuchsfutter 2 erhielten wichen nicht signifikant von den anderen beiden Fütterungsgruppen ab.

Des Weiteren unterschied sich der auf Gruppenbasis errechnete Futteraufwand je kg Zuwachs nach Angebot des Kontrollfutters, Versuchsfutter 1 oder Versuchsfutter 2 nicht signifikant.

Tabelle 15: Mittelwerte (±Standardabweichungen) der Futteraufnahme (g/Tier) und des Futteraufwandes während der Fütterungsphase Mast II (d28-0) sowie die Körpermassen (Angaben in g) am Ende des Versuchs (Tag 0; entspricht Lebenstag 43)

Kontrollfutter Versuchsfutter 1 Versuchsfutter 2

𝑥̅ s 𝑥̅ s 𝑥̅ s

Futteraufnahme

(g/Tier, d28-0) 3817^a ±47,2 3698^b ±48,4 3793^ab ±55,0 Körpermassen (g)

an Tag 0 2828^a ±33,1 2761^b ±28,1 2824^ab ±38,4

Futteraufwand

(d28-0) 1,57 ±0,01 1,56 ±0,01 1,55 ±0,01

a,b ungleiche Buchstabeninnerhalb einer Zeile kennzeichnen signifikant unterschiedliche Werte (p < 0,05)

Durchgang 2