2. Material und Methoden
2.3. Nährmedien, Antibiotika und Lösungen
2.3.4. Puffer und Lösungen
2.3.4.1. Lösungen zur Isolierung von Plasmid-DNA
Tabelle 2-14: Lösungen zur Isolierung von Plasmid-DNA.
Bezeichnung Bestandteile Konzentration Bemerkungen
Lösung I
(Resuspensionspuffer)
Tris-Base Na4EDTA RNase A
50 mM 10 mM 100 µg/ml
pH 8,0 mit HCl einstellen, RNase A (Tabelle 2-23) vor Gebrauch frisch zusetzen Lösung II
(Lysepuffer)
NaOH SDS
0,2 M 1% (w/v)
nicht autoklavieren Lösung III
(Neutralisierungspuffer)
Kaliumacetat 3 M pH 5,2 mit Eisessig einstellen, Lagerung bei 4 °C
2.3.4.2. Lösungen zur Isolierung von genomischer DNA aus Ascomyceten
Tabelle 2-15: Verwendete Lösungen zur Isolierung von pilzlicher gDNA.
Bezeichnung Bestandteile Konzentration/Volumen Bemerkungen
Extraktionspuffer Tris-Base NaCl
Na4EDTA SDS
-Mercaptoethanol
100 mM 250 mM 25 mM 0,5% (w/v) 1% (v/v)
pH 8,0 mit HCl einstellen,
-Mercaptoethanol frisch vor Gebrauch zusetzen
Chloroform/Isoamylalkohol (24:1)
Chloroform Isoamylalkohol
24 ml 1 ml TES-Puffer Tris-Base
Na4EDTA SDS Proteinase K
-Mercaptoethanol
100 mM 10 mM 2% (v/v) 0,2 mg/ml 1,5% (v/v)
pH 8,0 mit HCl
einstellen, Proteinase K und -Mercaptoethanol vor Gebrauch frisch zusetzen
2.3.4.3. Lösungen zur Gelelektrophorese
Tabelle 2-16: Lösungen zur Agarose-Gelelektrophorese.
Bezeichnung Bestandteile Konzentration Bemerkungen
50x TAE Tris-Base Essigsäure 96%
Na4EDTA (pH 8,0)
2 M 400 mM 50 mM 6x Probenpuffer Glycerol
Bromphenolblau
30% (v/v) 0,25% (w/v)
Tabelle 2-17: Lösungen zur SDS-PAGE.
Bezeichnung Bestandteile Konzentration Bemerkungen
Laufpuffer Tris-Base Glycin
SDS
25 mM 192 mM 0,1% (w/v) Trenngel (12%) Tris•HCl (pH 8,8)
Rotiphorese® Gel 30 SDS
APS TEMED Wasser
375 mM 12% (w/v) 0,1% (w/v) 0,1% (w/v) 0,1% (w/v) ad 10 ml
APS als letzten Bestandteil
unmittelbar vor dem Gießen zugeben
Sammelgel (4%) Tris•HCl (pH 6,8) Rotiphorese® Gel 30 SDS
APS TEMED Wasser
125 mM 4% (w/v) 0,1% (w/v) 0,1% (w/v) 0,1% (w/v) ad 10 ml
APS als letzten Bestandteil
unmittelbar vor dem Gießen zugeben
5x Probenpuffer Tris•HCl (pH 6,8) DTT
SDS
Bromphenolblau Glycerol
250 mM 500 mM 10% (w/v) 0,05% (w/v) 50% (v/v)
Lagerung bei -20 °C
Bezeichnung Bestandteile Konzentration Bemerkungen Färbelösung Coomassie Brilliant Blau G-250
Methanol Essigsäure Wasser
0,25% (w/v) 45% (w/v) 10% (w/v) 45% (w/v)
Lagerung vor Licht geschützt
Entfärbelösung Methanol Essigsäure Wasser
45% (w/v) 10% (w/v) 45% (w/v)
2.3.4.4. Lösungen zur Proteinreinigung
Tabelle 2-18: Puffer zur Reinigung von überproduzierten Proteinen aus E. coli mittels
Nickel-Affinitätschromatographie und zur Gelfiltration. Alle Puffer zur Proteinreinigung wurden bei 4 °C gelagert.
Bezeichnung Bestandteile Konzentration Bemerkungen
Lysepuffer NaH2PO4
NaCl Imidazol Lysozym
50 mM 300 mM 10 mM 1mg/ml
pH 8,0 mit NaOH einstellen, Lysozym vor Gebrauch frisch zugeben
Waschpuffer NaH2PO4
NaCl Imidazol
50 mM 300 mM 20 mM
pH 8,0 mit NaOH einstellen
Elutionspuffer NaH2PO4
NaCl Imidazol
50 mM 300 mM 250 mM
pH 8,0 mit NaOH einstellen
Aufbewahrungspuffer Tris-Base Glycerol
50 mM 15% (v/v)
pH 7,5 mit HCl einstellen
Tabelle 2-19: Puffer zur Reinigung von überproduzierten Proteinen aus E. coli mittels Glutathion-Sepharose-Affinitätschromatographie.
Bezeichnung Bestandteile Konzentration Bemerkungen
10× PBS NaCl KCl Na2HPO4
KH2PO4
1,4 M 27 mM 100 mM 18 mM
pH 7,3 einstellen
Elutionspuffer Tris-Base reduziertes Glutathion
50 mM 10 mM
pH 8,0 mit HCl einstellen
Tabelle 2-20: Puffer zur Reinigung von überproduzierten Proteinen aus E. coli unter denaturierenden Bedingungen und zur Renaturierung.
Bezeichnung Bestandteile Konzentration Bemerkungen 10× IB Waschpuffer Tris-Base
Na4EDTA Triton X-100
200 mM 100 mM 10% (v/v)
pH 7,5 mit HCl einstellen
10× IB
Solubilisierungspuffer
CAPS 500 mM pH 11,0 mit NaOH einstellen
30% N-Laurylsarkosin N-Laurylsarkosin 30% (w/v) Lysepuffer Tris-Base
Na4EDTA Saccharose
50 mM 1 mM 25% (w/v)
pH 8,0 mit HCl einstellen
Bezeichnung Bestandteile Konzentration Bemerkungen Inclusion Body Puffer 1
(IB1)
Tris-Base NaCl
Na-desoxycholat EGTA
20 mM 0,2 M 1% (w/v) 2 mM
pH 8,0 mit HCl einstellen
Inclusion Body Puffer 2 (IB2)
Tris-Base Na-desoxycholat EGTA
10 mM 0,25% (w/v) 1 mM
pH 8,0 mit HCl einstellen
Solubilisierungspuffer Harnstoff NaN3
EGTA Tris-Base
8 M 0,1 mM 1 mM 10 mM
pH 8,0 mit HCl einstellen
50× Dialysepuffer Tris-Base 1 M pH 8,5 mit HCl einstellen
Tabelle 2-21: Besondere Puffer zur Reinigung von überproduzierten Proteinen aus S. cerevisiae.
Bezeichnung Bestandteil Konzentration Bemerkungen
Yeast Breaking Buffer Tris-Base Glycerol DTT PMSF
50 mM 15% (v/v) 1 mM 1 mM
pH 7,5 mit HCl einstellen, PMSF vor Gebrauch frisch zugeben
2.3.4.5. Puffer, Lösungen und Medien für die Protoplastierung und Transformation von A. niger AB1.13
Tabelle 2-22: Lösungen zur Protoplastierung und Transformation von A. niger AB 1.13.
Bezeichnung Bestandteile Konzentration/Volumen/
Menge
Bemerkungen 20× Nitratsalze NaNO3
KCl
MgSO4 7 • H2O KH2PO4
Wasser
120 g 10,4 g 10,4 g 30,4 g ad 1000 ml Spurenelemente ZnSO4 • 7 H20
H3BO4
MnCl2 • 4 H2O FeSO4 • 7 H2O CoCl2 • 6 H2O CuSO4 • 5 H2O (NH4)6Mo7O24 • 4 H2O Na4EDTA
Wasser
2,2 g 1,1 g 0,5 g 0,5 g 0,16 g 0,16 g 0,11 g 5 g ad 100 ml
pH 6,5 mit KOH einstellen, nicht autoklavieren, nach erfolgtem Farbumschlag nach Violett steril filtrieren, Lagerung bei 4 °C
GMM (Glucose-minimalmedium)
20× Nitratsalze Glucose Wasser
50 ml 10 g ad 1000 ml
pH 6,5 mit NaOH einstellen, autoklavieren, 1 ml
Spurenelemente steril zugeben, für pyrG-Stämme zusätzlich 2,4 g/l Uridin, zur Selektion von
pyrG-Stämmen zusätzlich 0,5 g/l 5-FOA
Osmotisches Medium, Lösung A
NaH2PO4 0,2 M
Osmotisches Medium, Lösung B
Na2HPO4 0,2 M
Bezeichnung Bestandteile Konzentration/Volumen/
Menge
Bemerkungen Osmotisches Medium,
Lösung C
Lösung A Lösung B
7 ml 93 ml Osmotisches Medium,
Lösung E
MgCl2
Lösung C
1,2 M 5 ml
pH 5,80 mit HCl oder Na2HPO4
einstellen, steril filtrieren, Lagerung bei 4 °C Trapping Buffer Sorbitol
Tris-Base
600 mM 100 mM
pH 7,0 mit HCl einstellen, Lagerung bei 4 °C STC-Puffer Sorbitol
CaCl2
Tris-Base
1,2 M 10 mM 10 mM
pH 7,5 mit HCl einstellen, Lagerung bei 4 °C Calcium-PEG-Lösung 1 M CaCl2
60% (w/v) PEG 3350
150 µl 2,85 ml
Stocklösungen autoklavieren, vor Gebrauch steril mischen Bottom-Medium 20× Nitratsalze
Glucose Sorbitol Wasser
50 ml 10 g 219 g ad 1000 ml
pH 6,5 mit NaOH einstellen, autoklavieren, 1 ml
Spurenelemente steril zugeben, für pyrG-Stämme zusätzlich 2,4 g/l Uridin
Top-Agar 20× Nitratsalze Glucose
Sorbitol Agar Wasser
10 ml 2 g 44 g 1,5 g ad 200 ml
pH 6,5 mit NaOH einstellen, autoklavieren, 0,2 ml
Spurenelemente steril zugeben, für pyrG-Stämme zusätzlich 2,4 g/l Uridin, vor Gebrauch auf ca. 45 °C temperieren
2.3.4.6. Sonstige Puffer und Lösungen
Tabelle 2-23: Sonstige Puffer und Lösungen.
Bezeichnung Bestandteile Konzentration/Volumen/
Menge
Bemerkungen 5× Bradford-Lösung Serva Blau R-250
Ethanol
85% Phosphorsäure Wasser
70 mg 50 ml 100 ml ad 200 ml
Lagerung im Dunkeln bei 4 °C
1× Bradford-Lösung 5× Bradford-Lösung Wasser
20 ml 80 ml
nach der Verdünnung filtriert, Lagerung im Dunkeln bei 4 °C
10× BSA BSA 1 mg/ml Lagerung bei -20 °C
1× BSA 10× BSA 1× BSA in Aufbewahrungspuffer (Tabelle 2-18) lösen, Lagerung bei -20 °C DNase I DNase I (min. 3000
U/mg)
1 mg/ml in DNase I Puffer lösen, Lagerung bei -20 °C DNase I Puffer Tris-Base
MgCl2
Glycerin
20 mM 1 mM 50% (w/v)
pH 7,5 mit HCl einstellen
FPLC-Puffer Tris-Base NaCl
50 mM 150 mM
pH 8,0 mit HCl einstellen, entgasen, Lagerung bei 4 °C
Natriumacetat zur DNA-Fällung
Natriumacetat 3 M pH 5,2 mit Eisessig einstellen
RNase A RNase A (U) 10 mg/ml nach dem Lösen 20 min auf 100 °C erhitzt
Bezeichnung Bestandteile Konzentration/Volumen/
Menge
Bemerkungen 10× Taq-Puffer KCl
Tris-Base Triton X-100 MgCl2
500 mM 100 mM 1% (v/v) 15 mM
pH 8,8 mit HCl einstellen