2. Material und Methoden
2.5 Methoden der Molekularbiologie
2.5.10 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Protoplasten in 220 µl STC-Puffer resuspendiert. Zweimal 10 µl Suspension wurden zur Bestimmung des Protoplastentiters abgenommen (s.u.).
Zur Transformation wurden ca. 10 µl des gewünschten Transformationskonstruktes mit STC-Puffer auf 100 µl aufgefüllt und mit 100 µl Protoplastensuspension gemischt. Nach 50 min Inkubation auf Eis wurde der Transformationsansatz zu 1,25 ml Calcium-PEG-Lösung in ein 15 ml-Reaktionsgefäß pipettiert, durch sanftes Rollen gemischt und 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde mit STC-Puffer auf 6 ml aufgefüllt. Jeweils 600 µl wurden auf eine Platte Bottom-Medium ohne Uridin pipettiert, sofort mit etwa 5 ml Top-Agar ohne Uridin übergossen und zum Verteilen der Transformanden vorsichtig geschwenkt. Die Inkubation erfolgte im Dunklen bei 30 °C.
Nach jeweils drei bis vier Tagen wurden sichtbare Transformantenkolonien zur weiteren Selektion zweimal auf GMM-Platten umgesetzt, wobei möglichst nur Sporen ausplattiert wurden.
Zur Bestimmung des Protoplastentiters wurden in einer Verdünnungsreihe (1×10-1 bis 1×10-8) jeweils 10 µl Protoplastensuspension mit 90 µl STC-Puffer verdünnt und wie beschrieben auf Bottom-Medium mit Uridinzusatz pipettiert und mit etwa 5 ml Top-Agar mit Uridinzusatz übergossen. Zur Bestimmung von nicht protoplastierten Zellen wurden 10 µl Protoplastensuspension statt in STC-Puffer in Wasserbidest. verdünnt, wodurch Protoplasten zum Platzen gebracht wurden. Nach zwei bis drei Tagen Inkubation wurden die gewachsenen Kolonien gezählt und der Protoplastentiter aus der Differenz der in STC-Puffer und in Wasser verdünnten Zellen bestimmt.
2.5.10.1 PCR zur Klonierung
Zur Amplifikation von Gensequenzen, die zur Klonierung verwendet wurden, wurde das Expand™ High Fidelity PCR System Kit (Tabelle 2-4) verwendet. Dieses Kit enthält ein Gemisch aus der Taq-Polymerase und einem hitzestabilen Protein ohne DNA-Polymerase-, jedoch mit Korrekturlese-Aktivität.
Tabelle 2-26: Bedingungen für Amplifikation von tdiA-Homologen.
Bestandteil Konzentration Schritt Temperatur [°C] Dauer [min] Zyklen template-DNA 5-500 ng gDNA Initiale
Denaturierung
94 5:00 1
Denaturierung 94 0:30
Primer (10 pmol/μl) je 0,4 µM Anlagerung variabel 1:00 30 dNTP (je 10 mM) je 0,2 mM Elongation 72 4:00
10× Puffer 1× Finale Elongation 72 7:00 1 High Fidelity
Polymerase
2,5 U Kühlung 4 ∞ 1
Die Anlagerungstemperatur für CHGG_03687 betrug 59 °C, für Homologe aus A. terreus 50 °C.
Bei Vorliegen von Intronsequenzen in der gDNA wurden die einzelnen Exon-Sequenzen getrennt amplifiziert, aufgereinigt und nacheinander in einer weiteren PCR miteinander fusioniert. Die gesamte kodierende Gensequenz wurde anschließend mit den beiden äußeren Primern (Primer 1 und 6, Abbildung 2-1) vervielfältigt und in den Klonierungsvektor pGEM®-T easy ligiert (Tabelle 2-4). Diese Methode wurde zur Herstellung der Klonierungskonstrukte pST14, pST22 und pST35 angewendet.
Abbildung 2-1: Schema der verwendeten Primer zur Amplifikation der Exons am Beispiel von CHGG_03684. Zahlen bezeichnen die verwendeten Primer. Primer, die im Inneren der Gensequenz binden, enthalten überlappende Sequenzen mit dem benachbarten Exon. Diese Sequenzen wurden genutzt, um die Exons in einer PCR miteinander zu fusionieren. Die Darstellung der Primer ist nicht maßstabsgerecht.
Tabelle 2-27: Bedingungen für Amplifikation von einzelnen Exons von CHGG_03684 und zur Fusion.
Bestandteil Konzentration Schritt Temperatur [°C] Dauer [min] Zyklen
template-DNA 5-500 ng
(gDNA)
Initiale Denaturierung
94 5:00 1
1-10 ng
(amplifizierte, gereinigte Exonsequenz)
Denaturierung 94 0:30
Primer (10 pmol/μl) je 0,4 µM Anlagerung 60 1:00 30 dNTP Mix (je 10 mM) je 0,2 mM Elongation 72 1:30
10× Puffer 1× Finale Elongation 72 7:00 1 High Fidelity
Polymerase
2,5 U Kühlung 4 ∞ 1
Tabelle 2-28: Bedingungen für Amplifikation von einzelnen Exons von ATEG_00702 und zur Fusion.
Bestandteil Konzentration Schritt Temperatur [°C] Dauer [min] Zyklen
template-DNA 5-500 ng
(gDNA)
Initiale Denaturierung 94 5:00 1
1-10 ng
(amplifizierte, gereinigte Exonsequenz)
Denaturierung 94 0:30
Primer (10 pmol/μl) je 0,4 µM Anlagerung 55 0:30 30 dNTP Mix (je 10
mM)
je 0,2 mM Elongation 72 variabel
10× Puffer 1× Finale Elongation 72 7:00 1 High Fidelity
Polymerase
2,5 U Kühlung 4 ∞ 1
DMSO 5% (v/v)
Die Elongationszeit für die Exons 1 und 2 betrug 1:00 min, für Exon 3 0:30 min, für die Fusion der Exons jeweils 1:00 min und für die Amplifikation der gesamten Sequenz 1:15 min.
Tabelle 2-29: Bedingungen für Amplifikation von einzelnen Exons von ATEG_09980 und zur Fusion.
Bestandteil Konzentration Schritt Temperatur [°C] Dauer [min] Zyklen template-DNA 5-500 ng
(gDNA)
Initiale Denaturierung 94 5:00 1
1-10 ng
(amplifizierte, gereinigte Exonsequenz)
Denaturierung 94 0:30
Primer (10 pmol/μl) je 0,4 µM Anlagerung 62 1:00 30 dNTP Mix (je 10
mM)
je 0,2 mM Elongation 72 1:30
10× Puffer 1× Finale Elongation 72 7:00 1 High Fidelity
Polymerase
2,5 U Kühlung 4 ∞ 1
2.5.10.2 PCR zur zielgericheten Mutagenese
Den Experimenten zur Einführung von zielgerichteten Mutationen lagen zwei unterschiedliche Protokolle zum DpnI-Verdau (Shenoy & Visweswariah 2003) und zum Primerdesign (Zheng et al., 2004) zugrunde. Zur Durchführung der PCR wurde das Expand™ High Fidelity PCR System Kit (Tabelle 2-4) verwendet.
Zum Austausch von Aminosäuren wurden je Mutation zwei Primer eingesetzt, die die jeweilige Mutation trugen. Jeder Primer hatte eine Länge von ca. 40 bp. Die Mutation befand sich dabei etwa 10 bp vom 5‘-Ende entfernt, ungefähr in der Mitte des komplementären Bereiches der beiden Primer. Am 5‘- als auch am 3‘-Ende lag möglichst entweder eine Guanin- oder eine Cytosinbase. Die Schmelztemperatur wurde um 80 °C angesetzt und nach folgender Formel berechnet:
Formel 2-3:Berechnung der Schmelztemperatur von Primern. Tm: Schmelztemperatur. % GC: prozentualer Anteil an GC-Basen. N: Gesamtzahl der Basen. % Fehlpaarung: prozentualer Anteil der fehlgepaarten Basen.
T 81,5 0,41 % GC 675
N % Fehlpaarung
Als template diente ein dam-methyliertes Expressionskonstrukt, das zuvor aus E. coli XL1-Blue MRF‘ aufgereinigt wurde. Die Bedingungen der PCR sind in Tabelle 2-30 dargestellt. Nach durchgeführter PCR wurden 40 µl des Ansatzes mit 20 U DpnI versetzt und für 4 h bei 37 °C inkubiert. Dabei erfolgte der Verdau der unmutierten, methylierten Ursprungs-Plasmid-DNA. 1 µl des Verdaus wurde zur Transformation (2.5.9.1.2) von E. coli XL1-Blue MRF‘ eingesetzt.
Abbildung 2-2: Schema eines Primerpaares zur Einführung von zielgerichteten Mutationen. Der schraffierte Bereich symbolisiert die komplementären Bereiche der Primer, Pfeile markieren die ungefähre Lage der Mutationen.
Tabelle 2-30: Bedingungen für die PCR zur zielgerichteten Mutagenese.
Bestandteil Konzentration Schritt Temperatur [°C] Dauer [min] Zyklen Plasmid-DNA 1-10 ng Initiale
Denaturierung
94 3:00 1
Primer (10 pmol/μl) je 0,6 µM Denaturierung 94 1:00 dNTP Mix (je 10
mM)
je 0,2 mM Anlagerung 55 1:00
16
10× Puffer 1× Elongation 68 5:30
High Fidelity Polymerase
2,5 U Finale Elongation 68 7:00 1
Kühlung 4 ∞ 1
2.5.10.3 Reverse Transkription von mRNA und Amplifikation von cDNA Die in 2.5.4 erhaltene Gesamt-RNA wurde zur Transkription mithilfe des Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kits (Tabelle 2-4) nach Herstelleranweisung eingesetzt.
Zunächst wurde die Gesamt-RNA nach folgendem Schema vorinkubiert und für 10 min bei 65 °C denaturiert:
Tabelle 2-31: Pipettierschema für den RNA-Primer-Mix.
Komponente Endkonzentration
Gesamt-RNA 1-4 µg
Anchored-oligo(dT)18 Primer (50 pmol/µl) 2,5 µM
Wasserbidest. ad 11,4 µl
Nach Abkühlen auf Eis wurden die folgenden Komponenten bis zu einem Gesamtvolumen von 20 µl in der angegebenen Reihenfolge hinzugefügt:
Tabelle 2-32: Pipettierschema für RT-Reaktion.
Komponente Endkonzentration 5× Transcriptor High Fidelity Reverse Transcriptase
Reaction Buffer
1× (8 mM MgCl2) Protector RNase Inhibitor (40 U/µl) 20 U
Desoxynukleotid-Mix (je 10 mM) je 1 mM
DTT (100 mM) 5 mM
Transcriptor High Fidelity Reverse Transcriptase 10 U
Die Komponenten wurden vorsichtig gemischt und zur Transkription für 30 min bei 50 °C inkubiert. Die Reverse Transkriptase wurde anschließend bei 85 °C für 5 min inaktiviert und der Ansatz auf Eis abgekühlt. Die erhaltene cDNA wurde direkt in einer PCR (Tabelle 2-33) eingesetzt, um die codierende Sequenz von CHGG_03684 zu erhalten.
Hierfür fand wiederum das Expand™ High Fidelity PCR System Kit Anwendung.
Tabelle 2-33: Bedingungen für Amplifikation von CHGG_03684 aus cDNA.
Bestandteil Konzentration/Volumen Schritt Temperatur [°C] Dauer [min] Zyklen
cDNA 5 µl Initiale
Denaturierung
94 2:00 1
Primer (10 pmol/μl)
je 0,2 µM Denaturierung 94 0:30 dNTP Mix (je 10
mM)
je 0,2 mM Anlagerung 62 1:00 30
10× Puffer 1× Elongation 72 1:30
High Fidelity Polymerase
2,5 U Finale Elongation
72 7:00 1
Kühlung 4 ∞ 1