8. Anhang und Protokolle
8.1 Protokolle für immunhistochemische Methoden
Nissl – Färbung
Krysylviolett färbt Zellkerne lila-blau und ist für die Gegenfärbung von Hirnschnitten gut geeignet.
Vorbereitung:
10g Krysylviolett in 1000ml bidest lösen 250ml einer 100% Ethanollösung ansetzen Filtrieren
Gegenfärbung: 1. Schnitte in Behälter unterschiedlich hoher Ethanolkonz. legen 1 Minute in 100% Ethanol
1 Minute in 90% Ethanol 1 Minute in 80% Ethanol 1 Minute in 70% Ethanol 1 Minute in 50% Ethanol
2. Schnitte für 1 Minute in Aqua bidest spülen 3. Schnitte für 5 Minuten in Krysylviolett geben 4. Schnitte kurz in Aqua bidest spülen
5. Schnitte in Behälter unterschiedlich hoher Ethanolkonz. legen 1 Minute in 50% Ethanol
1 Minute in 70% Ethanol 1 Minute in 80% Ethanol 1 Minute in 90% Ethanol 1 Minute in 100% Ethanol
6. Eindecken der Schnitte mit Eukitt
101
Antikörperinkubationen
Protokoll der Inkubation mit dem G-10 Anti-Reelin-Antikörper
Vorgang Dauer Temperatur
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Legen in 30% H2O2-Lösung 30 Minuten RT
Blocken 60 Minuten RT
Inkubieren mit G-10 ca. 24 Stunden 4° C
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Inkubieren mit biot. sek. AK 60 Minuten RT
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Legen in ABC-Lösung 60 Minuten RT
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Färben mit DAB 2 Minuten RT
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Aufziehen in 0,1% Gelatine Eindecken mit Eukitt
Ansätze für die Inkubation mit G-10 Anti-Reelin
30% H2O2 Lösung 5ml 4835 µl 0,1M PBS 165 µl 30% H2O2
Block 5ml
4700 µl 0,1M PBS 150 µl NGS
150 µl 10% Triton X
102 Primärer Antikörper G-10 Anti-Reelin 1:1000 2ml 1916 µl 0,1M PBS
60 µl 10% Triton X 20 µl NGS
4 µl G-10 Anti-Reelin 1:2 verdünnt
Sekundärer Antikörper biotinyliert goat-anti-mouse 1:400 2ml 1915 µl 0,1M PBS
60 µl 10% Triton X 20 µl NGS
5 µl Biotinylated goat-anti-mouse Antibody
Avidin-Biotin-Komplex 1:200 2ml 1915 µl 0,1M PBS
60 µl 10% Triton X 20 µl NGS
10 µl Avidin-Lösung
10 µl Biotin-Enzym-Lösung
DAB-Färbung 2ml 2000 µl 0,1M PBS 2 Tropfen DAB 2 Tropfen H2O2
103
Protokolle der Immunfluoreszenz-Doppelmarkierungen
Als Antikörper wurden für die Immunfluoreszenz-Doppelmarkierungen verwendet:
Name Herkunft gerichtet gegen Hersteller
G – 10 Anti-Reelin Maus Reelin Abcam, Cambridge
Anti-GAD 1 Ziege GAD 67 Biozol, Echingen
Anti-Calbindin Kaninchen Calbindin Chemicon,
Temecula
Anti-GFAP Kaninchen GFAP Synaptic Systems,
Göttingen
Anti-NG2 Hase NG2 Invitrogen, Oregon
Alexa 488 green Esel Maus Invitrogen, Oregon
Alexa 594 red Esel Maus Invitrogen, Oregon
Alexa 594 red Esel Ziege Invitrogen, Oregon
Alexa 488 green Esel Kaninchen Invitrogen, Oregon
104
Protokoll der Reelin- und Calbindin-Doppelmarkierung
Vorgang Dauer Temperatur
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Blocken 60 Minuten RT
Inkubieren mit G-10 ca. 24 Stunden 4° C
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Inkubieren mit Alexa 594 120 Minuten RT
donkey-anti-mouse red
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Inkubieren mit Anti-Calbindin ca. 24 Stunden 4° C
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Inkubieren mit Alexa 488 120 Minuten RT
donkey-anti-rabbit green
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Aufziehen in Aqua bidest.
Eindecken mit Aqua Polymount Abdichten mit Nagellack
Ansätze der Reelin- und Calbindin-Doppelmarkierung
Block
1880 µl 0,1M PBS 60 µl NHS
60 µl 10% Triton X
1. Primärer Antikörper G-10 Anti-Reelin 1:1000 1ml 958 µl 0,1M PBS
30 µl 10% Triton X 10 µl NHS
2 µl G-10 Anti-Reelin 1:2 vorverdünnt
105 Negativ-Kontrolle 1und 3 1ml
960 µl 0,1M PBS 30 µl 10% Triton X 10 µl NHS
1. Sekundärer Antikörper Alexa 594 donkey-anti-mouse red 1:700, 2ml 1914 µl 0,1M PBS
60 µl 10% Triton X 20 µl NHS
6 µl Alexa 594 donkey-anti-mouse red1:2 vorverdünnt
2. Primärer Antikörper Rabbit Anti-Calbindin 1:500, 1ml 956 µl 0,1M PBS
30 µl 10% Triton X 10 µl NHS
4 µl Anti-Calbindin 1:2 vorverdünnt
Negativ-Kontrolle 2 und 3, 1ml 960 µl 0,1M PBS
30 µl 10% Triton X 10 µl NHS
2. Sekundärer Antikörper Alexa 488 donkey-anti-rabbit green 1:700, 2ml 1914 µl 0,1M PBS
60 µl 10% Triton X 20 µl NHS
6 µl Alexa 488 donkey-anti-mouse green 1:2 vorverdünnt
106
Protokoll der Reelin- und GAD 67-Doppelmarkierung
Vorgang Dauer Temperatur
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Blocken 60 Minuten RT
Inkubieren mit G-10 ca. 24 Stunden 4° C
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Inkubieren mit Alexa 488 120 Minuten RT
donkey-anti-mouse green
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Inkubieren mit Anti-GAD 1 ca. 24 Stunden 4° C
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Inkubieren mit Alexa 594 120 Minuten RT
donkey-anti-goat red
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Aufziehen in Aqua bidest.
Eindecken mit Aqua Polymount Abdichten mit Nagellack
Ansätze der Reelin- und GAD 67-Doppelmarkierung
Block
1880 µl 0,1M PBS 60 µl NHS
60 µl 10% Triton X
1. Primärer Antikörper G-10 Anti-Reelin 1:1000 1ml 958 µl 0,1M PBS
30 µl 10% Triton X 10 µl NHS
2 µl G-10 Anti-Reelin 1:2 vorverdünnt
107 Negativ-Kontrolle 1und 3 1ml
960 µl 0,1M PBS 30 µl 10% Triton X 10 µl NHS
1. Sekundärer Antikörper Alexa 594 donkey-anti-mouse (red) 1:700, 2ml 1914 µl 0,1M PBS
60 µl 10% Triton X 20 µl NHS
6 µl Alexa 594 donkey-anti-mouse red1:2 vorverdünnt
2. Primärer Antikörper Goat Anti-GAD 67 1:200, 1ml 955 µl 0,1M PBS
30 µl 10% Triton X 10 µl NHS
5 µl Anti-GAD 67 1:2 vorverdünnt
Negativ-Kontrolle 2 und 3, 1ml 960 µl 0,1M PBS
30 µl 10% Triton X 10 µl NHS
2. Sekundärer Antikörper Alexa 488 donkey-anti-goat (red) 1:700, 2ml 1912 µl 0,1M PBS
60 µl 10% Triton X 20 µl NHS
8 µl Alexa 488 donkey-anti-goat red 1:2 vorverdünnt
108
Protokoll der Reelin- und GFAP-Doppelmarkierung
Vorgang Dauer Temperatur
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Blocken 60 Minuten RT
Inkubieren mit G-10 ca. 24 Stunden 4° C
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Inkubieren mit Alexa 594 120 Minuten RT
donkey-anti-mouse red
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Inkubieren mit Anti-GAD 1 ca. 24 Stunden 4° C
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Inkubieren mit Alexa 488 120 Minuten RT
donkey-anti-rabbit green
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Aufziehen in Aqua bidest.
Eindecken mit Aqua Polymount Abdichten mit Nagellack
Ansätze der Reelin- und GFAP-Doppelmarkierung
Block
1880 µl 0,1M PBS 60 µl NHS
60 µl 10% Triton X
1. Primärer Antikörper G-10 Anti-Reelin 1:1000 1ml 958 µl 0,1M PBS
30 µl 10% Triton X 10 µl NHS
2 µl G-10 Anti-Reelin 1:2 vorverdünnt
109 Negativ-Kontrolle 1und 3 1ml
960 µl 0,1M PBS 30 µl 10% Triton X 10 µl NHS
1. Sekundärer Antikörper Alexa 594 donkey-anti-mouse (red) 1:700, 2ml 1914 µl 0,1M PBS
60 µl 10% Triton X 20 µl NHS
6 µl Alexa 594 donkey-anti-mouse red1:2 vorverdünnt
2. Primärer Antikörper Rabbit Anti-GFAP 1:700, 1ml 957,2 µl 0,1M PBS
30 µl 10% Triton X 10 µl NHS
2,8 µl Anti-GFAP 1:2 vorverdünnt
Negativ-Kontrolle 2 und 3, 1ml 960 µl 0,1M PBS
30 µl 10% Triton X 10 µl NHS
2. Sekundärer Antikörper Alexa 488 donkey-anti-rabbit (green) 1:700, 2ml 1914 µl 0,1M PBS
60 µl 10% Triton X 20 µl NHS
6 µl Alexa 488 donkey-anti-mouse green 1:2 vorverdünnt
110
Protokoll der Reelin- und NG2-Doppelmarkierung
Vorgang Dauer Temperatur
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Blocken 60 Minuten RT
Inkubieren mit G-10 ca. 24 Stunden 4° C
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Inkubieren mit Alexa 594 120 Minuten RT
donkey-anti-mouse red
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Inkubieren mit Anti-NG2 ca. 24 Stunden 4° C
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Inkubieren mit Alexa 488 120 Minuten RT
donkey-anti-rabbit green
Waschen in 0,1M PBS 3x 10 Minuten RT
Aufziehen in Aqua bidest.
Eindecken mit Aqua Polymount Abdichten mit Nagellack
Ansätze der Reelin- und NG2-Doppelmarkierung
Block
1880 µl 0,1M PBS 60 µl NHS
60 µl 10% Triton X
1. Primärer Antikörper G-10 Anti-Reelin 1:1000 1ml 958 µl 0,1M PBS
30 µl 10% Triton X 10 µl NHS
2 µl G-10 Anti-Reelin 1:2 vorverdünnt
111 Negativ-Kontrolle 1und 3 1ml
960 µl 0,1M PBS 30 µl 10% Triton X 10 µl NHS
1. Sekundärer Antikörper Alexa 594 donkey-anti-mouse (red) 1:700, 2ml 1914 µl 0,1M PBS
60 µl 10% Triton X 20 µl NHS
6 µl Alexa 594 donkey-anti-mouse red1:2 vorverdünnt
2. Primärer Antikörper Rabbit Anti-NG2 1:700, 1ml 957,2 µl 0,1M PBS
30 µl 10% Triton X 10 µl NHS
2,8 µl Anti-NG2 1:2 vorverdünnt
Negativ-Kontrolle 2 und 3, 1ml 960 µl 0,1M PBS
30 µl 10% Triton X 10 µl NHS
2. Sekundärer Antikörper Alexa 488 donkey-anti-rabbit (green) 1:700, 2ml 1914 µl 0,1M PBS
60 µl 10% Triton X 20 µl NHS
6 µl Alexa 488 donkey-anti-mouse green 1:2 vorverdünnt
112
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Methylgrün Wasserstoffperoxid (H2O2)
Xylol