Proteinexpression des Etched1 in Bakterien

Die Herstellung eines Etched1-Fusionsproteins sollte, mittels des NEB IMPACT-CN Systems durchgeführt, zur Isolation des Etched1 Proteins dienen. Das IMPACT-CN System basiert auf der Herstellung von Fusionsproteinen, die in Bakterien überexprimiert und über Affinitätschromatographie mit Chitin aufkonzentriert werden können. Diese Aufreinigung des überexprimierten Fusionsproteins ist durch eine Chitin-Bindedomäne des Inteins möglich.

Ferner besitzen die Fusionsproteine eine, über DTT induzierbare, Schnittstelle, die die Abspaltung des Zielproteins vom Fusionsproteins ermöglichen soll (s. Abb.7)

Abbildung 7 Prinzip des IMPACT-CN Systems. Das Fusionsprotein kann aufgrund der Chitin-Affinität der Inteindomäne am Säulenmaterial (bestehend aus Chitinbeads) binden und von anderen Proteinverunreinigungen gereinigt werden. Anschließend kann mit DTT das Zielprotein vom Fusionsprotein abgespalten werden.

Zur Herstellung der Konstrukte für die Intein-Fusionsproteine mußten modifizierte Primer hergestellt werden. Die Et1 cDNA sollte sowohl N-terminal (Vektor pTYB2), als auch C-terminal (Vektor pTYB12) über NdeI und XhoI Schnittstellen, hinter bzw. vor die Inteinsequenz, kloniert werden. Es mußte daher ein Primer mit NdeI–Schnittstelle und einem Startcodon für den 5´Bereich des Etched1 Gens ausgesucht werden. Ein zweiter (Rückwärts-) Primer mußte mit einer XhoI-Schnittstelle im 3´ translatierten Bereich des Gens versehen sein.

Original-Sequenz 5` C AAA GCG GCT ATG ACG ACG ACG GCC GCC GG 3`

a) Sequenz Primer NdeI 5` C AAA GCG CAT ATG ACG ACG ACG GCC GCC GG 3`

Original-Sequenz 5` GTG GAC ACC AGT TCT GAA GAT TGA TCT GCT G 3`

Modifizierte Sequenz 5` GTG GAC ACC AGT TCT GAA GAT CTC GAG GCT G 3`

b) Sequenz Primer XhoI 3`CAC CTG TGG TCA AGA CTT CTA GAG CTC CGA C 5`

Außerdem wurden separat der LC cDNA Bereich, der der Signalsequenz des ET1-Proteins entspricht, und der cDNA Bereich, der der AS-Sequenz des TFIIS-homologen Bereiches aus dem ET1 entspricht, mittels PCR und den entsprechenden modifizierten Primern amplifiziert.

Dabei wurde ein Startcodon vor dem TFIIS homolgogen Bereich eingefügt

Original TFIIS-homolog 5` GTC ATT GAT ATA AAG CTT CCT AGA AGA AGC 3`

c) Primer NdeI TFIIS 5` GCT ATT CAT ATG AAG CTT CCT AGA AGA ACC 3`

Original Sequenz 5` TCC TCC TCC GGC GAG GCC AAT TCG GAC GCG 3`

Modifizierte Signalsequenz 5` TCC TCC TCC CTC GAG GCC AAT TCG GAC GCG 3`

d) Primer XhoI Signalsequenz3` AGG AGG AGG GAG CTC CGG TTA AGC CTG CGC 5`

Primer Positionen im Etched1 Gen

a) ^CAAAGCGCATATGACGACGACGGCCGCCGG

CGTTGTCTGACAGGCAAAGCGGCTATGACGACGACGGCCGCCGGGCACGGCTGC TGCTGGGCGGGGATTCCGCCCTTCGCGTTGTTGCCGCGGATTCTCTCGACCGGC CGGGAGACTCCTCCTCCTCGCGCTTCCCTTGTCGCCTCCTCCTCGAAGCTCAGG GCGCTGGCACCGCGGCTGAGAGTTTCGAACCGTCCAAGGAGGCTCATTGTCTCC TCCTCCTCCCTCGAGGCCAATTCGGACGCG c)

GCTTCCTCCTCCGGCGAGGCCAATTCGGACGCGGTGCCGTCGCCAACGGAAGCC d)GCTATTCATATGAAGCTTCCTAGAAGAAGC

GCTATTGATATAAAGCTTCCTAGAAGAAGCTTGCTTGTTCAATTTACATGCAAC GCATGTGGCGAAAGGACCAAGCGCTTGATAAACAGAGTAGCCTATGAAAGAGGC ACAGTTTTTCTTCAGTGTGCAGGGTGCCAGGTGTACCATAAGTTTGTTGATAAT CTTGGGCTAGTTGTTGAGTATGATCTACGAGAAGAAAACGAGCTACAAGGAGAA b)GGTGGACACCAGTTCTGAAGATCTCGAGGCTG

AATGCGGTGGACACCAGTTCTGAAGATTGATCTGCTGTGAGAAGCGATGTTGGT ATGCAAAACGCCCTGTACTCTGTAGGTTTTTGACAACATTGGTTATTTGTATAG CATAAAAATGGCACTTTTTAAAGTTGTTGCACATACTCATCTGAAATTCTGAAT ACAGCAGGGCCTACATTGTACTTTTT(A)60

Abbildung 8 Positionen der modifiierten Primer innerhalb des Etched1 Gens Schwarz sind Startcodons, kursiv und unterstrichen NdeI und XhoI-Schnittstellen dargestellt Pfeile zeigen die Richtung der PCR

Durch PCR des Plasmids pBluescriptc9.1 mit Pwo Proofreading Polymerase konnte die ca.

700 bp grosse Bande (Primerpaar zur Amplifkation des gesamten Etched1 cDNA-Bereiches), aus einem 0.7%igen Agarosegel ausgeschnitten und über das Pharmacia/Biotech DNA + Gel Band Purification Kit isoliert werden. Ebenso konnten auch der vordere und der hintere Teilbereich der Etched1 cDNA in einer PCR mit den modifzierten Primern amplifiziert werden. Diese Amplifikate, die in ihrer AS Sequenz der Signalsequenz, bzw. dem TFIIS-homologen Bereich entsprechen, wurden ebenfalls über das Pharmacia/Biotech DNA + Gel Band Purification Kit aus einem Agarosegel isoliert.

PCR Ansätze

1 µl Template pBSc9.1(50 ng/µl) 5 µl 10x Komplettpuffer

1,5 µl dNTP-Mix 10 mM

1,5 µl forward Primer 10 pM NdeI / NdeI TFIIS homolog 1,5 µl reverse Primer 10 pM XhoI / XhoI Signalsequenz 37,5 µl H2O

1µl DMSO

1µl Pwo Polymerase + Mineralöl

Bedingungen:

96°C, 2 min Denaturierung 96°C, 45 sec. Denaturierung

63-65°C, 45 sec. Annealing der Primer 25 Zyklen 72°C, 2 min Auffüllreaktion

72°C, 10 min. Abschluß 4°C, endlos

Die PCR Produkte wurden zur Sequenzierung in den TOPO-Vektor kloniert (s. 2.2.1.13).

Nach der Sequenzierung der Klone mittels Universal und Reverse Primern wurden Maxipräparationen der Plasmide (Gibco-Maxi-Präp-Kit) gemacht. Die Plasmide und die Vektoren pTYB2 und pTYB12, kloniert in den Vektor TOPO wurden mit den Enzymen NdeI und XhoI geschnitten. Inserts und restringierte Vektoren wurden aus dem Gel isoliert (Pharmacia/Biotech DNA + Gel Band Purification Kit), zusammenligiert und in ER2566 E.coli kompetente Zellen transformiert. Danach wurden die Klone für die Fusionsproteine noch einmal durch Sequenzierung, auf den richtigen Leserahmen hin überprüft.

Folgende sechs verschiedene Plasmide wurden auf diese Weise hergestellt:

-Etched1 cDNA in pTYB2 -Etched1cDNA in pTYB12

-5´Bereich der Etched1cDNA in pTYB2, der Signalsequenz des ET1-Proteins entspricht -5´Bereich der Etched1cDNA in pTYB12, der Signalsequenz des ET1-Proteins entspricht -3´Bereich der Etched1cDNA in pTYB2, der TFIIS-homologen Bereich des ET1-Proteins entspricht

-3´Bereich der Etched1cDNA in pTYB12, der TFIIS-homologen Bereich des ET1-Proteins entspricht

Mit diesen Plasmiden sollten Intein Fusionsproteine in den ER2566 kompetenten Zellen überexprimiert werden (2.2.4.5).

Da das Fusionsprotein aus dem TFIIS-homologen Bereich, C-terminal in den Vektor pTYB12 kloniert, als einziges überexprimiert wurde, erfolgte die Aufreinigung über eine Säule mit Chitinbeads. 5 ml Säulenmaterial wurden mit 45,0 ml Column Buffer 20 min, unter gelegentlichem Schütteln, bei 4°C im Erlenmeyerkolben equilibriert. Alle weiteren Schritte erfolgten ebenfalls bei 4°C im Kühlraum. Nach der Equilibrierung der Chitinbeads wurde der Puffer durch eine Zentrifugation entfernt und 10 ml des Überstandes, welcher das o. g.

Fusionsprotein enthalten sollte, hinzugegeben. Beads und Überstand wurden dann für 60 min geschüttelt. Danach wurde die Suspension in eine Säule gegeben und der aufgefangen. Dann wurde das Säulenmaterial 4x mit dem 2,5 fachen Ausgangsvolumen Column Buffer gewaschen und die Waschfraktionen ebenfalls aufbewahrt. Anschließend wurde das dreifache Säulenvolumen Cleavage Buffer, bis auf ein wenig Überstand über dem Säulenmaterial, durch die Säule gegeben und die Säule verschlossen. Der Durchlauf des Cleavage Buffer wurde ebenfalls aufbewahrt und die Säule wurde ü.N. bei 4°C stehen gelassen.

Am nächsten Tag wurde abermals das dreifache Säulenvolumen Cleavage Buffer (aber ohne DTT) durch die Säule gegeben und 1,5 ml-Fraktionen gesammelt. Von allen Fraktionen wurden Proteinbestimmungen nach Bradford durchgeführt. Dabei stellte sich heraus, daß die Proteingehalte in den Elutionsfraktionen über eine Bradford-Bestimmung nicht meßbar waren.

Deshalb wurde die Säulenaufreinigung des pTYB12 TFIIS-homologen ET1-Intein-Fusionsprotein mit frisch transformiertem, überexprimiertem und lysiertem Bakterienüberstand wiederholt. In den Elutionsfraktionen waren diesmal Proteingehalte meßbar. Die Proteingele mit den Proben wurden silbergefärbt (Abb. 22, 3.2.2)