Handelt es sich bei dem klonierten Gen tatsächlich um das von der etched1 Mutation betroffene Gen?
4.7 Ausblick
5 Zusammenfassung
Die pleiotrope Mutation etched1 bei Zea mays L. bewirkt bei Maiskörnern und in Maissämlingen deutlich sichtbare Entwicklungsstörungen der Plastiden. Dabei zeigen reife Körner eine Vielzahl von Rissen und Fissuren, vor allem im Bereich der oberen Endospermschichten. In extremer Ausprägung des Phänotyps sind die Körner sehr stark deformiert und nicht mehr keimfähig. Junge Sämlinge aus etched1-Mutanten hingegen zeigen einen „virescenten“ Phänotyp. Die ersten beiden Blätter der Pflanzen sind weiß bis blaßgrün, aber regenerieren sich 10 bis 15 Tage nach der Keimung zu normal grünen Blättern. Alle weiteren Blätter der etchedI-Pflanzen sind gleich von Anfang an genauso grün wie Blätter einer Wildtyp-Pflanze in der gleichen Wachstumsphase.
In dieser Arbeit sollte vorrangig die Fragestellung bearbeitet werden ob und wie das von da Costa é Silva klonierte Etched1 Gen in etched1-Mutantenlinien vorhanden ist, die über Transposonumlagerung (mit dem Mutatorelement) hergestellt wurden. Die Sequenzanalyse unterschiedlicher etched1-Mutantenlinien hat gezeigt, daß das Etched1 Gen in allen Linien durch die Insertion eines Mutatorelementes mutiert ist. Außerdem hat sich gezeigt, daß es für die Insertion von Mutatorelementen innerhalb des Etched1 Gens einen Hot Spot im Bereich des Exon1 gibt. Die Insertionspräferenzen der Mutatorelemente führten dazu, daß in vier von fünf bisher analysierten Linien die Insertionen innerhalb von vier Basenpaaren, kurz vor dem Startcodon des Etched1 Gens erfolgten. Dabei sind je zwei der vier Mutantenlinien bezüglich der Insertionssequenz/Zielsequenz ihres Mutatorelementes (Mu8) identisch (Linien et1-m3/et1-m15 bzw. et1-m10/et1-m12). Sie unterscheiden sich teilweise aber durch die Orientierung (Insertionsrichtung) des Mutatorelements und den genetischen Hintergrund.
Durch biolistische Transformation hergestellte transgene Et1-Pflanzen und ihre Analyse zeigten zum Teil einen „etched1-ähnlichen“ Phänotyp in Körnern und Sämlingen. Dies gibt einen weiteren Hinweis darauf, daß das untersuchte Gen tatsächlich für die etched1-Mutation verantwortlich ist.
Durch in situ Experimente mit sense und antisense RNA-Sonden der kompletten Etched1-cDNA, konnte die Expression des Gens in Maiskörnern des Wildtyps nachgewiesen werden.
Die Expression des Etched1 Gens scheint im Bereich des Aleurons, den äußeren
Die Effizienz des Photosystems II, ermittelt durch Messung der Chlorophyllfluoreszenz, ist bei Sämlingen von et1-ref-Pflanzen deutlich niedriger als bei transgenen Etched1-Sense- und Wildtyp-Pflanzen. Durch die Messung wird deutlich, daß die et1-Mutation nicht nur auf anatomischer, sondern auch auf physiologischer Ebene Einfluß auf die Chloroplasten-Entwicklung nimmt. Dieser Einfluß konnte bei den transgenen Linien nicht nachgewiesen werden.
In Westernblots, die mit dem Gesamtprotein und dem Chloroplastenprotein verschieden alter Wildtyp und et1-ref Pflanzen, mit Etched1-Antiseren, durchgeführt wurden, konnten vermutlich nur unspezifische Protein-Banden detektiert werden. Bei einem spezifischen Nachweis für das ET1-Protein hätte man Proteine mit einem Molekulargewicht von 11 kDa in den Chloroplasten (prozessiertes Protein) und 18 kDa im pflanzlichen Gesamtproteinextrakt erwartet. Proteine mit einem Molekulargewicht von 11 kDa konnten aber auch in Wildtyp-Chloroplasten nie mit den Antiseren nachgewiesen werden. Alle in Wildtyp-Chloroplasten detektierten Proteine waren mindestens 17 kDa groß.
Weiterführende Analysen der Arbeitsgruppe Krupinska/Universität Kiel deuten darauf hin, daß aufgereinigte EtchedI-Antikörper bei der Immunodetektion mit verschiedenen hochaufgereinigten Chloroplastenfraktionen von Mais und Spinat ein 11 kDa großes Protein detektieren, das Teil des „transcriptionally active chromosome“ ist (Krupinska, Müller, pers.
Mitteilung).
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen die erfolgreiche Klonierung des Etched1 Gens aus Zea mays. Durch die umfangreiche Analyse Mutator-induzierter Mutantenlinien und das Auftreten eines „etched1-ähnlichen“ Phänotyps in Etched1-transgenen Pflanzen, konnte gezeigt werden, daß Mutationen des Etched1 Gens mit etched1-Phänotypen korrelieren. Das putative ET1-Protein könnte in die Regulation der frühen Plastidenentwicklung in Körnern und Blättern, möglicherweise als Komponente des TAC-Komplexes, involviert sein. Somit könnte das ET1-Protein an Metabolismen beteiligt sein, die direkt oder indirekt in die Plastidenentwicklung eingreifen. Es sind aber noch weitere vertiefende Analysen nötig, um die Art der Interaktion des Etched1 Genproduktes innerhalb der Plastidenentwicklung näher charakterisieren zu können.
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7 Anhang
7.1 Darstellung der Positionen der verwendeten Primer innerhalb der Etched1cDNA von LC
(c9.1)
Abb.48
250 500 750
c9.1 gesamtsequenz(1>662) Et1(1>20)
Et c9.1(1>164) Et10(1>20) Et12(1>18) Et c9.1(165>252) ex2 for(1>24) ex2 rev(1>24) Et c9.1(253>381) Et11(1>18) Et13(1>25) ex3 rev(1>24) ex3 for(1>24) Et c9.1(382>662) Et2(1>20)
ex4 for(1>24) ex4 rev(1>24)
Basenpaare
7.2 Darstellung der Positionen der verwendeten Primer innerhalb der genomischen Et1-DNA (LC)
Abb. 49
1000 2000 3000 4000 5000
LC Et1(1>4018) prom for(1>24) prom rev(1>24) Et1(1>20) Et c9.1(1>164) Et10(1>20) Et12(1>18) Et c9.1(165>252) ex2 for(1>24) ex2 rev(1>24) Et c9.1(253>381) Et11(1>18) Et13(1>25) ex3 rev(1>24) ex3 for(1>24) Et c9.1(382>662) Et2(1>20)
ex4 for(1>24) ex4 rev(1>24)
Basenpaare