Proteinbiochemische Methoden

4.2.8. Proteinbiochemische Methoden

4.2.8.1. Isolierung des Gesamtproteins aus Gewebe und Zellkulturproben

Wie unter Punkt 4.2.2.1. (Seite 40) beschrieben wurden MN9D-Zellen zur Proteinisolation nach Transfektion der Zellen trypsiniert und durch Zentrifugation in einem 15 ml-Falcon-Röhrchen sedimentiert. Das Zellpellet wurde nun in 5 ml kaltem Homogenisierungspuffer resuspendiert und bei 250 g und 4 °C für 5 min abzentrifugiert. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt und schließlich das Zellpellet in 100 µl Homogenisierungspuffer (siehe Punkt 4.1.10., Seite 33) aufgenommen. Die Zellprobe wurde an einem Stab-Ultraschallgerät für dreimal 5 s zur Zerstörung von Komponenten der Zellmembran beschallt. Durch die Hitzeentwicklung war eine Kühlung der Probe auf Eis zwischen den einzelnen Ultraschall-Gaben notwendig. Die Proteinkonzentration wurde gemäß Punkt 4.2.8.2. (Seite 75) photometrisch bestimmt. Bis zur gelelektrophoretischen Auftrennung wurden die Proteine bei −80 °C gelagert.

4.2.8.2. Photometrische Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford

Die Konzentration von Proteinlösungen (Punkt 4.2.8.1., Seite 75) erfolgte gemäß der Konzentrationsbestimmung nach Bradford. Diese Methode basiert auf der proportionalen Anlagerung des Coomassie-Farbstoffes an Proteine. Die Absorption des Farbstoffes wird anschließend photometrisch bei einer Wellenlänge (λ) von 595 nm gemessen und anhand einer parallel erstellten Standardkurve die Proteinkonzentration errechnet. Für Gesamtprotein-proben, isoliert aus MN9D-Zellen, wurde eine 1:20, eine 1:40 sowie eine 1:80 Verdünnung in A. bidest verwendet. Stammte die Probe von primären Neurospheres, so wurde aufgrund der erwarteten geringen Konzentration ein 1:5 und eine 1:10 Verdünnung in A. bidest verwendet. Die Regressionsgerade wurde anhand der Absorptionen (A595 nm) einer BSA-Reihe bekannter Konzentration erstellt (0,1 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,7 mg/ml sowie 1 mg/ml A. bidest). Zu jeweils 25 µl der Verdünnung wurde 1 ml des 1fach konzentrierten Bradford-Reagenz zugegeben und die Ansätze gut gemischt. Nach einer Inkubation von 10 min bei RT wurden die Proben in Einwegküvetten überführt, Luftblasen entfernt unddie Absorption der Proben bei einer Wellenlänge von λ = 595 nm gemessen.

4.2. Methoden: 4.2.8. Proteinbiochemische Methoden

4.2.8.3. Größenabhängige Auftrennung von Proteinen durch diskontinuierliche SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die Auftrennung der Proteinproben erfolgte durch diskontinuierliche SDS-PAGE in einer Mini-Protean-Gelapparatur (Bio-Rad). Nach Entfettung der beiden Glasplatten (7×8,3 cm×0,1 cm) wurden Abstandhalter (0,5cm Breite×0,15cm Tiefe) links und rechts zwischen die Glasplatten eingefügt, die Glasplatten in die Gelhalterung eingesetzt und schließlich in die Gießvorrichtung eingespannt. Die vorbereitete Lösung des Trenngels wurde zum Starten der Polymerisationsreaktion mit 50 µl APS (10% Ammoniumpersulfat) und 20 µl TEMED versetzt, gut gemischt und bis zu einem Abstand von ca. 2 cm zur oberen Glaskante zwischen die Glasplatten pipettiert. Bis zur vollständigen Polymerisation wurde das Trenngel mit Butanol überschichtet. Nach 20 h wurde das Butanol durch mehrmaliges Spülen mit A. bidest entfernt und restliche Flüssigkeit mit etwas Vliespapier abgesogen.

Danach wurde der Probenkamm zur Bildung der Auftragstaschen zwischen die Glasplatten eingesetzt. Der angesetzten Lösung des Sammelgels wurden 50 µl APS (10 %) und 20 µl TEMED (Tetramethylethylendiamin) zugefügt, die Lösung gevortext und mit einer 1 ml-Pipette langsam an der Seite des Probenkammes auf das Trenngel pipettiert.

9%iges Trenngel Sammelgel

4×Tris/HCl-SDS; pH 8,8 3,75 ml 4×Tris/HCl-SDS pH 6,8 3,50 ml

A. bidest 6,75 ml A. bidest 7,16 ml

Bisacrylamid (30%) 4,50 ml Bisacrylamid (30%) 0,65 ml

10% APS 50 µl 10% APS 50 µl

TEMED 20 µl TEMED 20 µl

Nach erfolgter Polymerisation des Sammelgels wurde das Gel aus der Gießapparatur genommen, in die Elektrophoresekammer eingesetzt und diese mit 1× Laufpuffer bis zur oberen Gelkante gefüllt. Der Probenkamm wurde vorsichtig entfernt und die Geltaschen mittels einer 25 µl-Hamilton-Spritze mit Laufpuffer gespült. Die Proteinproben wurden nun mit 6× Protein-Probenpuffer versetzt und bei 95 °C für 5 min denaturiert und direkten an die Denaturierung anschließend auf Eis gekühlt. Die Volumina der Proteinproben wurden nun in die Geltaschen pipettiert. Zur Abschätzung des Molekulargewichtes wurden 8 µl des

„prestained“-Protein-Standards (BioRad) mitaufgetragen. Die Elektrophorese wurde bei 90 V begonnen und nachdem die Proben das Trenngels erreicht hatten, wurde die

4.2. Methoden: 4.2.8. Proteinbiochemische Methoden

Spannung auf 120 V erhöht. Sobald die Lauffront die untere Gelkante erreicht hatte, wurde die Elektrophorese beendet.

4.2.8.4. Western-Blot-Analyse

Gegen Ende der elektrophoretischen Auftrennung der Proteinproben wurde eine PVDF-Membran in der Größe des Trenngels zugeschnitten und für den Proteintransfer vorbereitet. Hierzu wurde die Membran zunächst für 1 min in Methanol gelegt und schließlich bis zum Aufbau des Transfers in Transferpuffer äquilibriert. Nach Beendigung der SDS-PAGE wurde das Gel der Kammer entnommen und das Trenngel mittels Skalpell vom Sammelgel getrennt. Der Blot wurde von Kathode zu Anode in einem „Blotsandwich“

wie folgt aufgebaut: Begonnen wurde mit einem puffergetränkten Schwämmchen, hierauf wurde ein angefeuchtetes Whatman-Papier gegeben und auf dieses die PVDF-Membran.

Nun wurde auf die Membran das Trenngel gelegt und die obere linke Kante der Membran gekennzeichnet. Auf das Trenngel wurde ein weiteres, puffergetränktes Whatman-Papier gegeben. Zur Entfernung möglicher Luftblasen wurde vorsichtig eine Pipette über den Transferaufbau gerollt. Zuletzt wurde ein nasses Schwämmchen aufgelegt und der

„Blotsandwich“ geschlossen. Dieser wurde nun in die Blotapparatur zwischen Anode und Kathode so eingesetzt, dass das Trenngel sich auf der Seite der Kathode befand. Die Kammer wurde vollständig mit Transferpuffer gefüllt. Mit Hilfe eines Magnetrührers wurde das Durchmischen des Transferpuffers sichergestellt. Der Transfer erfolgte ü. N. bei 18 V und 4 °C.

Nach Beendigung des Proteintransfers wurde die PVDF-Membran entnommen und zur Überprüfung des Transfers für 1 min in Ponceau S-Lösung geschwenkt. Nach unspezifischer Anfärbung der Proteine wurde die Membran solange in A. bidest gewaschen, bis einzelne Banden sichtbar wurden. Zur Entfärbung der Membran wurde diese dreimal kurz in PBS (0,1% Tween-20) gewaschen. Die nachfolgenden Inkubationsschritte und Waschungen des Western-Blots erfolgten unter stetigem, leichtem Schwenken auf einem Horizontalschüttler bei 200 Upm. Die PVDF-Membran wurde zweimal für 5 min in TTBS (0,1% MP) gewaschen, woran sich ein 15minutiger Waschschritt anschloss. Die Absättigung der Membran wurde durch Inkubation in TTBS mit 3% MP für 8 h bei 4°C vorgenommen.

Hiernach erfolgte die Bindung des primären Antikörpers. Es wurde ein polyklonaler, in Kaninchen hergestellter und gegen Sim1 gerichteter Antikörper in einer Verdünnung von 1:1000 in TTBS (0,1% MP) benutzt. Die Bindung des Primärantikörpers an das Sim1-Epitop erfolgte ü. N. bei 4°C unter kontinuierlichem, leichten Schwenken. Am darauffolgenden Tag wurde die Membran mehrmals wie zuvor beschrieben gewaschen. Als sekundärer