Proteinbiochemische Methoden

Zur Extraktion zellulärer Proteine wurden zwischen 1 x 10⁷ und 6 x 10⁷ Zellen nach einmaligem Waschen mit PBS (Zentrifugation bei 4°C, 300 rcf, fünf Minuten) in 200-750 µl eiskaltem Lysepuffer resuspendiert. Waren die Zellen zuvor mit Kollagen stimuliert worden, wurde ausschließlich PBS ohne Calcium und Magnesium verwendet. Anschließend wurde das Lysat in ein vorgekühltes 2 ml

49 Reagiergefäß überführt und für 30 Minuten bei 4°C auf einem Rotationsmischgerät (15 rpm) inkubiert, um eine vollständige Lyse zu erzielen. Zum Entfernen des Zelldebris wurde das Lysat bei 17000 rcf und 4°C für 30 Minuten pelletiert. Der Überstand wurde abgenommen und in ein vorgekühltes 1,5 ml Reagiergefäß überführt. Bis zur Verwendung wurden die Lysate bei -20°C aufbewahrt.

3.2.2.2 Herstellung von nukleären und zytoplasmatischen Proteinlysaten

Zur Abgrenzung nukleärer Proteine von zytoplasmatischen Proteinen wurde zur Herstellung von nukleären und zytoplasmatischen Proteinlysaten das Qproteome® Nuclear Protein Kit von QIAGEN (Hilden) verwendet und nach dem Protokoll „Isolation of Nuclear Proteins from Mammalian Cells“

des Qproteome® Nuclear Protein Handbuchs verfahren. Von den im Protokoll angegebenen Volumina wurde jeweils ein Vierzigstel eingesetzt. Die vorausgehende Transfektion der Zellen wurde wie unter 3.2.1.8.4 beschrieben, durchgeführt. Es wurden jedoch nur 1,0 x 10⁶ HEK-293T Zellen ausgesät und stellvertretend das Verhältnis von Promotor zu Transkriptionsfaktor von 1:1 untersucht.

3.2.2.3 Proteinbestimmung nach Bradford

Zur Bestimmung der Proteinkonzentration der Ganzzelllysate wurde der Bradford-Test angewandt.

Der Test beruht auf der Bindung des Farbstoffes Coomassie Brilliantblau G-250 an basische und aromatische Gruppen der Proteine, welches das Absorptionsmaximum des Farbstoffes von 465 nm auf 595 nm erhöht. Die Absorption bei 595 nm kann photometrisch bestimmt werden und korreliert mit der Proteinkonzentration im Lysat. Für die Bestimmung der Proteinkonzentration wurde das BioRad-Dye-Reagenz 1:5 und das Lysat 1:10 mit autoklaviertem Aquadest verdünnt. In einer Einmalküvette wurden dann zu 20 µl verdünntem Lysat 980 µl des Reagenz gegeben. Um die absolute Proteinkonzentration bestimmen zu können, wurde außerdem eine BSA-Protein-Standardreihe (200, 400, 600, 800, 1000 µg/ml) aus je 20 µl BSA-Proteinstandard bzw. Wasser (negative Blindprobe) und 980 µl verdünntem Reagenz hergestellt. Alle Mischungen wurden 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend die Absorption bei 595 nm im Spektralphotometer (BioPhotometer) gemessen. Die absolute Proteinkonzentration ergibt sich durch Abgleich mit der negativen Blindprobe und der Standardreihe.

3.2.2.4 Immunpräzipitation

Die Immunpräzipitation bezeichnet die Ausfällung von Protein-Antikörper-Komplexen. Es wurden 700 µg Protein eines Gesamtzelllysates eingesetzt, das Volumen mit Lysepuffer (ohne Aprotinin, PMSF und OV) auf 500 µl aufgefüllt und über Nacht mit 0,2-1,4 µg spezifischem Antikörper auf einem Rotationsmischgerät (15 rpm) bei 4°C inkubiert. Alle folgenden Arbeitsschritte, soweit nicht anders angegeben, wurden bei 4°C durchgeführt. Dann wurden 30 µl Protein A-Agarose zur Bindung der gebildeten Komplexe zugegeben und für weitere 5 Stunden auf dem Rotationsmischgerät inkubiert.

Die Immunpräzipitate wurden nach dreimaligem Waschen (Zentrifugation bei 510 rcf für je 2 Minuten) mit je 1 ml Lysepuffer (ohne Aprotinin, PMSF und OV) in 30 µl Lämmli-Puffer aufgenommen und sofort bei 95°C für 5 Minuten aufgekocht. Die Proteinanalyse erfolgte wie in SDS-PAGE (3.2.2.5), Western Blot (3.2.2.6) und Protein-Detektion (3.2.2.7) beschrieben direkt im Anschluss oder die Proben wurden bis zu ihrer Verwendung bei -20°C gelagert.

50 3.2.2.5 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)

Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese dient zur elektrophoretischen Auftrennung eines Proteingemisches nach dem Molekulargewicht der Proteine. Die Proteine werden durch das im Probenpuffer und im Gel enthaltene stark negativ geladene SDS denaturiert und ihre Eigenladung wird überdeckt. Beim Anlegen einer Spannung wandern die linearisierten, negativ geladenen Proteine dann nur noch in Abhängigkeit ihres Molekulargewichtes durch die Acrylamid-Gelmatrix in Richtung Anode. Kleinere Proteine wandern dabei schneller als Größere. Je nach Molekulargewicht der zu untersuchenden Proteine wird ein variierender Acrylamidgehalt des Trenngels von 7,5%, 10%, 12,5% oder 18% eingesetzt, für niedrig molekulare Zielproteine ein höher prozentiges Trenngel. Das Trenngel wurde in eine Gel-Kassette gegossen und mit Wasser überschichtet. Nachdem das Trenngel polymerisiert war, wurde das Wasser abgekippt, das 4%-ige Sammelgel auf das Trenngel gegossen und ein Kamm, der die Geltaschen formt, eingesetzt. Das im Trenn- und Sammelgel enthaltene Ammoniumpersulfat (APS) und Tetramethylethylendiamin (TEMED) führen die Polymerisation des Gels herbei. Bei der Herstellung der Gellösungen ist die Reihenfolge in der und das Verhältnis in dem die einzelnen Bestandteile gemischt werden entscheidend. Nach Auspolymerisieren des Gels wurde es entweder sofort verwendet oder bis zur Verwendung binnen einer Woche im Kühlschrank bei 4°C feucht gehalten.

Zusammensetzung der Trenn- und Sammelgellösungen:

Trenngel 7,5% 10% 12,5% 18%

autoklaviertes Aquadest 2,85 ml 2,19 ml 1,25 ml 50 µl

Tris-HCl Puffer (pH 8,8) 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml

Polyacrylamid

(Rotiphorese® Gel 30)

2 ml 2,66 ml 3,33 ml 4,80 ml

SDS (10%) 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl

APS (10%) 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl

TEMED 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl

Sammelgel 4%

autoklaviertes Aquadest 3 ml Tris-HCl Puffer (pH 6,8) 1,25 ml Polyacrylamid

(Rotiphorese® Gel 30)

0,65 ml

SDS (10%) 50 µl

APS (10%) 25 µl

TEMED 5 µl

In jede Geltasche wurde die gleiche Menge Proteinlysat (meist 30 µg) geladen. Die Lysatproben wurden mit Wasser auf das gleiche Volumen aufgefüllt, 1:1 mit Lämmli-Puffer gemischt und fünf Minuten bei 95°C aufgekocht. Bei der Beladung des Gels mit einem Immunpräzipitat wurden 10 µl der Probe eingesetzt und vor der Beladung für fünf Minuten bei 95°C aufgekocht. Nach dem Aufkochen und vor dem Beladen des Gels wurden die Proben kurz zentrifugiert. Ein Molekulargewichtsstandard wurde jeweils in die erste Tasche eines Gels pipettiert. Die Elektrophorese wurde in einer mit Elektrophoresepuffer gefüllten Proteingelelektrophoresekammer bei 65 mA durchgeführt. Wenn der Lauffrontmarker (Bromphenolblau) das untere Gelende erreicht hatte, wurde die Elektrophorese beendet.

51 3.2.2.6 Western Blot

Im Anschluss an die SDS-PAGE wurden beim Western Blot nach dem Semi-Dry-Blot-Verfahren die Proteine vom Gel auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen. In den Semi-Dry-Blotter wurden auf drei auf Gelgröße zugeschnittene, in Transblot-Puffer mit Methanol getränkte Blottingpapiere die zugeschnittene Nitrocellulose-Membran, darauf das Gel und dann wieder drei zugeschnittene, in Transblot-Puffer getränkte Blottingpapiere luftblasenfrei gelegt. Der Proteintransfer erfolgte bei 250 mA für 90 Minuten.

3.2.2.7 Protein-Detektion

Der Nachweis der auf die Nitrocellulose-Membran übertragenen Proteine erfolgt mittels spezifischer Antikörper. Zunächst wurden die Banden des Molekulargewichtsstandards nach dem Blotten mit einem Bleistift markiert. Zur Überprüfung eines erfolgreichen Proteintransfers auf die Nitrocellulose-Membran wurde die Nitrocellulose-Membran nach dem Transfer bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln für 1-2 Minuten mit Ponceau-Lösung gefärbt. Der Farbstoff bindet an positiv geladene Aminogruppen der Proteine und kann durch anschließendes Waschen und Blockieren wieder entfernt werden. Das Waschen und Blockieren erfolgte unter Schütteln (150 rpm) bei Raumtemperatur. Gewaschen wurde durch einmaliges, kurzes Schütteln in Aquadest, blockiert dreimal für je 20 Minuten in G-Net, Rinderserumalbumin oder in 5% Milchpulver gelöst in TBST. Das Blockieren der Membran dient dem Absättigen unspezifischer Proteinbindestellen, so dass der Nachweisantikörper dort nicht binden kann. Zum Nachweis des gewünschten Proteins wurde die Membran schließlich bei 4°C auf einem Rollenmischer mit einem spezifischen Primärantikörper in G-Net, Rinderalbuminserum oder 5% Milchpulver gelöst in TBST in entsprechender Verdünnung über Nacht inkubiert. Dann wurde nach dreimaligem Waschen der Membran für je 10 Minuten mit TBST, 60 Minuten unter Schütteln mit einem speziesspezifischen, Meerrettichperoxidase- (HRP-) markierten Sekundärantikörper (Verdünnung meist 1:20000 in G-Net, Rinderalbuminserum oder 5% Milchpulver gelöst in TBST) bei Raumtemperatur inkubiert. Nach anschließenden drei Waschschritten mit TBST für je 10 Minuten erfolgte die Visualisierung. Der Sekundärantikörper bindet an den konstanten Teil des Primärantikörpers, der wiedrum an das Protein gebunden ist und visualisert mit Hilfe der Peroxidase die spezifische Proteinbindung. Dazu wurde zunächst frisch angesetzte Lösung von Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate auf die Membran gegeben, zwei bis fünf Minuten inkubiert und die Membran in eine Expostitionskassette überführt. Dabei katalysiert die Peroxidase dann die Umwandlung des in der Lösung enthaltenen Luminols in ein lumineszierendes Produkt. Die lumineszierenden Signale werden mit einem Hyperfilm detektiert (Exposition bei geschlossener Kassette meist zwischen 1 Sekunde und 3 Minuten) und ggf. mit Hilfe der Software Image J quantifiziert.

3.2.2.8 Strippen der Nitrocellulosemembran

Um dieselbe Nitrocellulose-Membran zur Detektion eines anderen Proteins mit einem anderen Antikörper erneut verwenden zu können, muss der zuvor an die Membran gebundene Antikörper zunächst entfernt werden. Hierzu wurde die Membran mit Spripping-Puffer in einem Hybridisierungsinkubator für 40 Minuten bei 56°C inkubiert. Anschließend wurde dreimal 20 Minuten mit TBST gewaschen und dann dreimal 20 Minuten mit G-Net, Rinderserumalbumin oder 5% Milchpulver gelöst in TBST blockiert. Im Anschluss konnte die Nitrocellulose-Membran mit einem neuen Primärantikörper über Nacht inkubiert werden.

52 3.2.2.9 Sandwich Enzyme-linked Immunosorbent Assay (Sandwich ELISA)

Der ELISA ist ein quantitativer Immunoassay, der auf einer enzymatischen Farbreaktion basiert. Beim Sandwich ELISA kommen zwei antigenspezifische Antikörper zum Einsatz. Der im Überschuss eingesetzte Fängerantikörper, der am Boden einer Mikrotiterplatte immobilisiert ist, bindet das Antigen. Durch Waschen werden nicht gebundene Substanzen entfernt. Durch Zugabe des Detektionsantikörpers wird dann das Antigen markiert. Wichtig ist, dass Fänger- und Detektionsantikörper spezifisch verschiedene Epitope des nachzuweisenden Anitgens binden. Der Detektionsantikörper ist entweder selbst durch ein Enzym markiert oder bindet wie in diesem Fall einen Enzym-gekoppelten Sekundärantikörper. Nach Zugabe des Detektions- und Sekundärantikörpers ist jeweils ein Waschschritt nötig, um überschüssige Antikörper zu entfernen. In jedem Fall kommt es nach Substratzusatz zu einem durch das Enzym katalysierten Substratumsatz, der sich in einer Farbreaktion zeigt. Durch Zugabe einer Stopplösung wird die Enzymreaktion beendet und die bis zu diesem Zeitpunkt gebildete Farbdichte photometrisch gemessen. Die Farbdichte korreliert mit der Antigenkonzentration. Es wurde nach dem Sandwich ELISA Protokoll „C Test Procedure“ des PathScan® Phospho-FLT3 (panTyr) Sandwich ELISA Kit gearbeitet. Zum Einsatz kamen 100 µg Ganzzelllysat, welches mit autoklaviertem Aquadest auf 100 µl aufgefüllt wurde. Die Messung erfolgte mit dem ELISA-Reader Sunrise™ der Firma Tecan Austria (Grödig, AUT).