Kompetitiver Wachstumsvorteil der OCI-AML3 FLT3-NPOS Zellen bei Proliferation

83 Alle Zelllinien mit einem ITD/WT-Verhältnis von größer eins reagierten nur anfänglich auf den FLT3-Inhibitor AC220 und proliferierten später wieder stärker als native OCI-AML3. Der kompetitive Wachstumsvorteil der OCI-AML3 FLT3-NPOS Zellen und OCI-AML3 FLT3-ITD-high Zelllinien gegenüber nativen OCI-AML3 kann durch den FLT3-Inhibitor AC220 nur über eine gewisse Dauer gehemmt werden.

AML-Patienten, die über einen längeren Zeitraum mit AC220 behandelt werden, entwickeln häufig Resistenzmutationen gegenüber AC220 [258]. Deshalb wurde nach zehnwöchiger Kokultur unter ständiger Anwesenheit von 20 nM AC220 die mRNA aus den Zellen isoliert, in cDNA umgeschrieben und mittels PCR der Bereich des FLT3-Gens amplifiziert, in dem die bekannten Resistenzmutationen D676, F691, G697, D835, D839 und Y842 auftreten. Die Sequenzierung des aufgereinigten PCR-Produktes ergab keine AC220 Resistenzmutation. So konnten bekannte AC220 Resistenzmutationen [258-260] als Grund für die einsetzende zunehmende Proliferation der OCI-AML3 FLT3-NPOS Zellen bzw. der OCI-AML3 FLT3-ITD-high Zelllinien ausgeschlossen werden.

Zusammenfassend lässt sich formulieren, dass je größer das ITD/WT-Verhältnis der OCI-AML3 FLT3-ITD Zelllinien ist, desto größer ist ihr kompetitiver Wachstumsvorteil gegenüber nativen OCI-AML3. Dieser Proliferationsvorteil kann teilweise durch Zugabe von 20 nM AC220 gehemmt werden.

4.1.3.3 Kompetitiver Wachstumsvorteil der OCI-AML3 FLT3-NPOS Zellen bei

84 24 Tagen, bei 10⁵ Zellen nach 31 Tagen (eine Maus ist an Tag 26 in Narkose verstorben) und bei 10³ Zellen erst nach 35 Tagen getötet werden.

4.1.3.3.2 Untersuchung des Wachstumsvorteils von OCI-AML3 FLT3-NPOS Zellen in vivo Um zu untersuchen, ob der kompetitive Wachstumsvorteil von polyklonalen OCI-AML3 FLT3-NPOS Zellen gegenüber nativen OCI-AML3 auch in vivo besteht, wurden Mischungen aus beiden Zelllinien in Mäuse injiziert. Der Versuchsaufbau ist in Abbildung 23 grafisch dargestellt.

Abbildung 23: Versuchsaufbau der kompetitiven Langzeitproliferation von nativen OCI-AML3 versus polyklonaler OCI-AML3 FLT3-NPOS Zellen in vivo. Native OCI-AML3 wurden mit polyklonalen OCI-AML3 FLT3-NPOS Zellen im Verhältnis 1:1 oder 10:1 gemischt und NSG-Mäusen intravenös appliziert. Eine detaillierte Übersicht über alle untersuchten Mischungen gibt Tabelle 23. Nach 4-6 Wochen erkrankten die Mäuse und mussten getötet werden. Die Zellen wurden aus Knochenmark, Leber und Milz isoliert. Eine Oberflächenfärbung mit einem APC-markierten CD45-Antikörper erlaubte die Unterscheidung humaner von murinen Zellen im FACS. Eine Unterscheidung zwischen nativen OCI-AML3 und polyklonalen OCI-AML3 FLT3-NPOS Zellen war möglich, da die polyklonalen OCI-AML3 FLT3-NPOS Zellen im Gegensatz zu nativen OCI-AML3 einen Fluoreszenzmarker (GFP) besaßen. Der Anteil GFP-positiver Zellen an der Gesamtmenge der humanen Zellen im FACS wurde ermittelt.

Tabelle 23: Übersicht über alle in vivo untersuchten Mischungen und deren Verhältnisse im Rahmen der kompetitiven Langzeitproliferation nativer OCI-AML3 versus polyklonaler OCI-AML3 FLT3-NPOS Zellen. Die ersten beiden Zeilen zeigen die Mäuse aus dem ersten, die letzten vier Zeilen die Mäuse aus dem zweiten Versuch.

Mischungsverhältnis

OCI-AML3 : OCI-AML3 FLT3-NPOS

Applizierte Zellzahl

Anzahl der Mäuse

Tage bis Analyse

1:1 10³ 3 kein Engraftment; 101 Tage

10:1 10³ 3 kein Engraftment; 101 Tage

1:1 10⁵ 2 verstorben; 41 Tage

1:1 10⁶ 1 29 Tage

10:1 10⁵ 2 39 Tage

10:1 10⁶ 1 39 Tage

85 Da im Vorversuch 10³ Zellen angewachsen waren, wurden in einer ersten Untersuchung der kompetitiven Proliferation von nativen OCI-AML3 und polyklonaler OCI-AML3 FLT3-NPOS Zellen je drei Mäusen 10³ Zellen in einem Mischungsverhältnis von 1:1 bzw. 10:1 appliziert. Wider Erwarten waren die Zellen auch nach 101 Tagen in keiner der Mäuse angewachsen. Eine Analyse der humanen, leukämischen Zellen in Knochenmark, Leber und Milz der Mäuse ergab sehr geringe Werte von 1,25%, 0,24% und 1,18%. Deshalb wurden in einem weiteren Versuch den Mäusen die gleichen Mischungen gespritzt, jedoch die Gesamtzellzahl auf 10⁵ (je zwei Mäuse) bzw. 10⁶ (je eine Maus) erhöht. Eine Maus starb während des Versuchs (1:1; 10⁵) und konnte nicht analysiert werden. Die Todesursache wurde nicht untersucht. Alle anderen Mäuse erkrankten 29-41 Tage nach Applikation der Zellmischungen. Es bestand kein Zusammenhang zwischen applizierter Zellzahl und Latenzzeit.

Deshalb wurde bei der Auswertung nicht nach applizierter Zellzahl unterschieden. Die erkrankten Mäuse zeigten Lähmungserscheinungen an den Hinterläufen. Beim ersten Auftreten der Lähmungserscheinungen wurden sie getötet und die Zellen aus Knochenmark, Leber und Milz isoliert und analysiert. Die isolierten Zellen wurden mit einem humanen APC-markierten CD45-Antikörper gefärbt, um humane und murine Zellen durchflusszytometrisch voneinander zu unterscheiden. Dies wurde in einem Vorversuch kontrolliert, in dem humane OCI-AML3 Zellen mit murinen Ba/F3 Zellen in definierten Verhältnissen gemischt und die Mischungen mit diesem Antikörper gefärbt wurden.

Bei der Analyse im FACS wurden die eingesetzten Mengenverhältnisse beider Zelllinien exakt wiedergefunden (Daten nicht gezeigt). Eine Unterscheidung zwischen nativen OCI-AML3 und polyklonalen OCI-AML3 FLT3-NPOS Zellen war aufgrund des GFP der transgenen Zellen möglich. In Abbildung 24 dargestellt sind die prozentualen Anteile GFP-positiver und GFP-negativer Zellen des Mischungsverhältnisses 10:1 im Knochenmark, der Leber und Milz. In allen drei Kompartimenten konnte der kompetitive Wachstumsvorteil der polyklonalen OCI-AML3 FLT3-NPOS Zellen gegenüber nativen OCI-AML3 bestätigt werden. Am stärksten ausgeprägt war dieser mit einem Anstieg auf durchschnittlich 53,6% im Knochenmark.

t=0 Knochenmark Leber Milz

% Zellen

0 20 40 60 80 100

120 OCI-AML3

OCI-AML3 FLT3-NPOS

Abbildung 24: Kompetitiver Wachstumsvorteil der polyklonalen OCI-AML3 FLT3-NPOS Zellen gegenüber nativen OCI-AML3 in vivo. Dargestellt ist der prozentuale Anteil GFP-positiver (OCI-AML3 FLT3-NPOS) sowie GFP-negativer (OCI-AML3) humaner, leukämischer Zellen, die aus dem Knochenmark, der Leber und der Milz isoliert wurden. Gezeigt ist jeweils der Mittelwert von drei Mäusen. t=0 bezeichnet das Mischungsverhältnis zum Zeitpunkt der Injektion.

86 Auch in einer der beiden Mäuse des Mischungsverhältnisses 1:1 vermehrten sich die polyklonalen OCI-AML3 FLT3-NPOS Zellen stärker als native OCI-AML3. In allen drei untersuchten Organen nahmen sie gleich stark von 50% auf 72,5-75,7% zu. Bei der anderen Maus hingegen, ging der prozentuale Anteil an polyklonalen OCI-AML3 FLT3-NPOS Zellen im Vergleich zur Ausgangsmischung zurück. Insgesamt hatten zwei Mäuse außerdem einen soliden Tumor im Bauchraum, der bei einer Maus zu 98,9% aus OCI-AML3 FLT3-NPOS Zellen und bei der anderen Maus zu 99,3% aus nativen OCI-AML3 bestand.

Die 1:1 und 10:1 Mischungen, die den Mäusen gespritzt wurden, wurden parallel auch in vitro kultiviert. Auch in vitro überwuchsen wie erwartet die polyklonalen OCI-AML3 FLT3-NPOS Zellen die nativen OCI-AML3. An Tag 41 nach Injektion in die Maus waren in vitro der prozentuale Anteil der polyklonalen OCI-AML3 FLT3-NPOS Zellen von 50% auf 88,1% bzw. von 10% auf 52,2% gestiegen (Daten nicht gezeigt).