Proteinbiochemische Methoden

2.6.12.2 Färbung von intrazellulären Molekülen für durchflusszytometrische Mes-sungen (FACS)

Um intrazelluläre Zytokine in T-Zellen zu quantifizieren, wurde die Ausschüttung der Zy-tokine durch Zugabe von 5 µg/ml Brefeldin A 4 Stunden vor Ende des Stimulationsassays gehemmt. Die T-Zellen wurden abgenommen und eine normale Färbung der Oberflächen-moleküle durchgeführt. Nach dem Waschen der Zellen wurden sie in 1 ml 2% PFA in PBS zum Fixieren aufgenommen. Nach 20 Minuten Inkubation auf Eis wurde dreimal ge-waschen und die T-Zellen in 50 µl Saponin-Puffer aufgenommen. Das Saponin permeabi-lisiert die Zellen, sodass die Antikörper in die Zelle eindringen können. Alle nachfolgen-den Färbe- und Waschschritte wurnachfolgen-den deshalb mit FACS-Saponin-Puffer durchgeführt.

Anschließend wurden die Zellen erst 15 min mit Cohn II und dann mit 1 µl anti-IFN-γ-bio bzw. anti IL-4-bio in 50 µl FACS-Saponin-Puffer für ca. 45 min inkubiert. Nach zweima-ligem Waschen mit FACS-Saponin-Puffer wurden die Zellen mit Strepavidin-Cy5 (1/100) oder AlexFlour488 (1/200) gefärbt. Nach 30 Minuten wurden die Zellen dreimal mit FACS-Saponin-Puffer gewaschen, in 250 µl FACS-Puffer aufgenommen und im FACS ausgewertet.

2.7 Proteinbiochemische Methoden

Ein Teil der Fab-Fragment dieser Arbeit wurden durch die Firma Biometec, Greifswald hergestellt. Die Herstellung erfolgte ebenfalls mit dem Immuno Pure Fab-Purification Kit der Firma Pierce und nach deren Protokoll. Die Qualität der Fab-Fragmente wurde über eine SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese bestimmt. Abb. 2.1.1 zeigt die Silberfärbung einer Probe der Fab-Fragmente, die durch die Firma BIOMETEC hergestellt wurden. Es ist zu erkennen, dass es sich um eine sehr saubere Präparation handelt, da außer dem Fab-Fragment keine weiteren Banden sichtbar sind. Genauso sauber sind auch die selber herge-stellten Präparationen der Antiköper BNI3 und UPC10, die in Abb. 2.1.2 zusehen sind.

Hierbei handelt es sich um eine 12%iges SDS-Gel, bei dem die Proteine anschließend mit Coomassie gefärbt wurden.

Abb. 2.1.1 Überprüfung der Qualität der BNI3 Fab-Fragment hergestellt durch die Firma BIOMETEC in der SDS-PAGE. 5 µl der Fab-Fragmente wurden auf ein 10%iges SDS-Gel aufgetragen. Die Proteine wurden anschließend durch eine Silberfärbung sichtbar gemacht.

BNI3 UPC10 20 kD

50 kD

Abb. 2.1.2 Überprüfung der Qualität der BNI3 und UPC10 Fab-Fragmente in der SDS-PAGE. 10 µl der Fab-Fragmente des anti-CTLA-4-Fab-Fragmentes BNI3 bzw. des Kontroll-Fab-Fragmentes UPC10 wurden auf ein 12%iges SDS-Gel aufgetragen. Die Proteine wurden anschließend durch eine Coomassie-Färbung sichtbar gemacht.

2.7.2 Umpufferung und Proteinkonzentration

Zur Dialyse von Flüssigkeitsmengen zwischen 0,5 und 3 ml wurde das Slide-A-Lyzer^® System der Firma Pierce verwendet. Die Be- und Entladung erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers. Die Dialyse erfolgte durch drei- bis viermaligen Austausch des Puffers (300 ml) nach jeweils mind. vier Stunden.

Um den Puffer sehr schnell, aber eventuell nicht so gründlich auszutauschen, wurden die Centricon-Säulen von Amicon verwendet. Die Säulen wurde den Herstellerangaben ent-sprechend gehandhabt.

Sollten Antikörper oder Fab-Fragmente in Lösung hochkonzentriert werden, wurde das Protein in Centricon 10-Filtersäulen gegeben und bei 4000 rpm und 4°C (Megafuge 1.3R, Heraeus) so lange zentrifugiert, bis die Lösung auf das gewünschte Volumen eingeengt war. Die Centricon 10 Filter halten Proteine, die größer als 10 kD sind, zurück.

2.7.3 Konzentrationsbestimmung nach Bradford

Für die Bestimmung von Proteinkonzentrationen zwischen 2 mg und 50 µg/ml wurden in einer 96-Vertiefungen-Flachbodenplatte 20 µl der zu messenden Probe gegeben und mit 250 µl Coomassie-Reagenz gemischt. Das Reagenz bildet mit Proteinen der Probe einen blauen Farbstoff. Bei 630 nm wurde die optische Dichte in einem ELISA-Reader be-stimmt. Für die Bestimmung von geringen Proteinkonzentrationen von 100 µg/ml bis ca. 1 µg/ml wurden je 100 µl Probe und 100 µl Coomassie-Reagenz verwendet. Die Proteinkon-zentration wurde durch Vergleich mit einer BSA-Standardkurve errechnet.

2.7.4 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die SDS-PAGE ermöglicht eine Auftrennung von Proteinen nach ihrer Größe. Das denatu-rierende Reagenz Natriumdodecyl-Sulfat (SDS) hebt die dreidimensionale Struktur der Proteine auf und „maskiert“ durch seine starke negative Ladung ihre Eigenladung, sodass die Wanderung der Proteine von Anode zur Kathode erfolgt und die Abhängigkeit der Wanderungsgeschwindigkeit von der Form und Eigenladung der Proteine vernachlässigt werden kann. Es wurden 7,5 %ige Polyacrylamidgele verwendet. Die Proben wurden mit 5x Beladungspuffer versetzt, 5 Minuten bei 95°C denaturiert und nach dem Abzentrifugie-ren auf das SDS-Gel geladen. Für die Silberfärbung wurde 1 µl 10 kD-Leiter-Proteinmarker eingesetzt. Die Elektrophorese erfolgte bei 150 V und 30 mA/Gel für ca.

eine Stunde.

2.7.5 Silberfärbung

Die Silberfärbung ist eine sensitive Färbemethode, mit der sich Proteinmengen ab 50 pg in Polyacrylamidgelen nachweisen lassen. Im Rahmen der Arbeit wurde sie verwendet, um die Reinheit von eigenen und von der Firma Biometec hergestellten

Fab-Fragment-Präparationen zu bestimmen. Dazu wurde das Polyacrylamidgel nach der SDS-PAGE (2.7.4) über Nacht fixiert und dann dreimal für mindestens 30 Minuten in 50%igem Etha-nol gewaschen und anschließend eine Minute in Sensibilisierungspuffer inkubiert. Nach dreimaligem Waschen für jeweils 20 Sekunden in ddH₂O wurde das Gel 20 Minuten in Imprägnierungspuffer gelegt. Nach drei Waschschritten für je 20 Sekunden in ddH₂O wur-de das Gel in Entwickler inkubiert, bis die Markerbanwur-den in ausreichenwur-der Stärke erkenn-bar waren. Anschließend wurde das Gel mehrfach mit ddH₂O gewaschen und bis zum Tro-ckenen in Fixierer bei 4°C gelagert. Vor dem abschließenden Trocknen zwischen zwei Seiten Cellophan, wurde das Gel für mindestens eine Stunde in dest. Wasser gelegt.

2.7.6 Coomassiefärbung

Durch eine Coomassiefärbung lassen sich Proteine zwar nicht so sensitiv anfärben, wie durch eine Silberfärbung, doch ist die Durchführung einfacher und nicht so zeitaufwendig.

Das Gel wird in die Coomassie-Färbelösung gelegt und bei Raumtemperatur für etwa eine Stunde geschüttelt. Dabei bindet der Ttriphenylmethanfarbstoff relativ unspezifisch an kationische und nichtpolare, hydrophobe Seitenketten der Proteine. Die Proteine werden gleichzeitig durch Essigsäure im Gel fixiert. Nicht an Protein gebundener Farbstoff wird durch wiederholtes Spülen mit ddH₂O ausgewaschen, bis das Gel ausreichend entfärbt ist.

Das Gel wird abschließend, wie unter 2.7.5 beschrieben, getrocknet.