Kinetik der T-Zellproliferation mit und ohne Blockade von CTLA-4

3. Ergebnisse

3.1 Blockade von CTLA-4 bei einer allogenen Immunantwort

3.1.7 Wie wirkt die CTLA-4 Blockade?

3.1.7.2 Kinetik der T-Zellproliferation mit und ohne Blockade von CTLA-4

Da eine erhöhte Überlebensrate von aktivierten T-Zellen als Grund für die verstärkte Proli-feration unwahrscheinlich ist, bleiben zwei weiterer Mechanismen, die diese Verstärkung erklären können: Es könnte sich die Kinetik der Aktivierung beschleunigen, d.h. die T-Zellen werden schneller aktiviert und haben nach sieben Tagen bereits ein oder zwei Zell-zyklen mehr durchlaufen als T-Zellen, deren CTLA-4 nicht blockiert wird. Es ist auch möglich, dass die Anzahl der ruhenden T-Zellen steigt, die überhaupt aktiviert werden, dass also insgesamt mehr T-Zellen rekrutiert werden. In diesem Fall wäre die Kinetik der Aktivierung gleich, aber die Zahl der proliferierenden Zellen würde steigen. Beide Szena-rien würden im Endeffekt zu einem verstärkten Einbau von ³H-Thymidin führen, ließen sich also mit dieser Methode nicht unterscheiden.

Um zwischen den beiden Möglichkeiten zu unterscheiden, wurden die T-Zellen daher vor Beginn des jeweiligen Experiment mit grün-fluoreszierendem CFSE markiert. Mit jeder Zellteilung wird der Farbstoff auf die zwei Tochterzellen verteilt. Über die Halbierung der Fluoreszenz im grünen Kanal (Fl-1) lässt sich so die Zahl der Zellen bestimmen, die sich geteilt haben und auch angeben, wie viele Zellzyklen sie durchlaufen haben. Dem entspre-chend befinden sich in den FACS-Abbildungen die Zellen, die sich nicht geteilt haben ganz rechts auf der X-Achse. In den nachfolgenden FACS-Abbildungen (ab 3.1.7.2.2) sind die sich teilenden Zellen auf der X-Achse (Fl-1) gegen die Expression von CD4 bzw. CD8 auf der Y-Achse (Fl-4) aufgetragen.

Die T-Zellen wurden wie oben beschrieben mit SkMel wt bzw. SkMel B7.2 stimuliert und für 3, 5 und 7 Tage mit oder ohne anti-CTLA-4-Fab-Fragment oder Gesamtantikörper in-kubiert. Anschließend wurden die T-Zellen mit anti-CD4-Cy5 bzw. anti CD8-Cy5 gefärbt und im FACS-Calibur ausgewertet. Die Analyse der Proliferation nach 3, 5 und 7 Tagen, bei der durch Verwendung von CFSE jede sich teilende Zelle sichtbar wird, gab Auf-schluss darüber, wann die ersten Zellen anfangen, sich zu teilen. Dadurch wird auch sicht-bar, ob dies unter dem Einfluss einer Blockade des CTLA-4 schneller geschieht als bei einer normalen allogenen Stimulation.

A B

proliferierende Lymphozyten ruhende Lymphozyten

tote Zellen,

Überreste der SkMel

Abb. 3.1.7.2.1 Unterschiede zwischen aktivierten und nichtaktiviereten T-Zellen im FACS. Der For-ward/Sideward-Blot zeigt das unterschiedliche Erscheinungsbild von T-Zellen, die entweder sieben Tage mit SkMel wt (A) oder SkMel B7.2 (B) stimuliert wurden. Die roten Punkte repräsentieren die proliferierenden T-Zellen. Alle Zellen innerhalb des gates wurde für die Abb. 3.1.7.2.2-4 ausgewertet.

In Abb. 3.1.7.2.1 sind die Forward/Sideward-blots der FACS-Auswertung dargestellt. Abb.

3.1.7.2.1A zeigt die mit SkMel wt stimulierten T-Zellen und Abb. 3.1.7.2.1B die mit SkMel B7.2 stimulierten T-Zellen. Schon an Hand dieser Abbildungen lässt sich erkennen, dass die T-Zellen von den Wildtyp-Zellen nicht aktiviert wurden, da diese klein und rund bleiben und so mit eine homogene Population bilden. Proliferierende T-Zellen wurden dagegen größer und zeigten eine entsprechend andere Lage im Forward/Sidward-Blot bei der FACS-Analyse. Die roten Punkte in Abb. 3.1.7.2.1B zeigen die Lymphozyten, die auf den allogenen Stimulus mit Proliferation reagierten. Das gate für die Auswertung der Proli-feration wurde so gewählt, dass die Überreste der SkMel und sterbende Zellen möglichst sauber von den T-Zellen getrennt wurden. Es zeigte sich aber, dass dies nicht immer mög-lich war. Dies hatte zur Folge, dass ein Teil dieser Reste bei der Darstellung Fl-1 (CFSE) gegen FL-4 (Cy5) im unteren linken Quadranten auftauchte (z.B. Abb. 3.1.7.2.2). Dies

erschwerte die Auswertung der statistische Daten, da der Anteil an Zellfragmenten u.ä.

nicht eindeutig zu bestimmen war. Die angegeben Prozentzahlen beziehen sich deshalb immer auf die Anzahl der CD4⁺ bzw. CD8⁺-T-Zellen und nicht auf die gesamten gemesse-nen Ereignisse.

Nach drei Tagen war keine Proliferation sichtbar, weder bei Stimulation mit SkMel B7.2 noch mit SkMel wt (Abb. 3.1.7.2.2). Auch führte die Zugabe von 10 µg/ml anti-CTLA-4-Fab-Fragment noch nicht zu einer Proliferation. Diese zeigte, dass eine Blockade von CTLA-4 nicht zu einer schnelleren Aktivierung und damit Beginn der Zellteilung zu ei-nem früheren Zeitpunkt der T-Zellen führt (Abb. 3.1.7.2.2 rechte Spalte).

Auch nach fünf Tagen Stimulation mit SkMel wt sind dort keine proliferierenden T-Zellen sichtbar (Abb. 3.1.7.2.3). Bei einer Stimulation mit den B7.2 transfizierten SkMel sind jetzt erstmals T-Zellen sichtbar, die sich im Schnitt einmal geteilt haben. Einige wenige CD4⁺-T-Zellen in der Kontrolle und jetzt schon deutlich mehr CD4⁺-T-Zellen nach der Blockade von CTLA-4 haben geteilt. Es scheint so, als würden die T-Zellen bis zu 4-5 Tage brauchen, bis sie nach einer allogenen Stimulation anfangen zu proliferieren.