Proteinaseinhibitoraktivitäten

Verschiedene Behandlungsvarianten wie Herbivorenfraß, Applikation von Signalstoffen (Jasmon- und Salicylsäure, Ethylen, Methyljasmonat und Methylsalicylat) sowie die Inkubation mit flüchtigen Duftstoffen (Methylanthranilat, cis-3-Hexenylacetat, cis-Jas-mon, Ocimen, Linalool, Caryophyllen, C11- und C16-Homoterpen) wurden auf ihre Auswirkungen bezüglich Proteinaseinhibitor-Aktivitätsveränderungen untersucht (Kap.

4.4.1.1). Die Aktivitätsveränderungen der Proteinaseinhibitoren in den Blättern von A. glutinosa wurden nach 72-stündiger Inkubation mittels des Radialdiffusionsassays quantifiziert. Unbehandelte Blätter von A. glutinosa wiesen eine Grundaktivität der Proteinaseinhibitoren von 3,76 ± 0,39 µg mg^-1 Protein g^-1 FW auf (Abb. 30 ). Nach Her-bivorenfraß von A. alni-Larven erhöhte sich diese signifikant auf 20,6 ± 2,17 µg mg^-1 Protein g^-1 FW und lag damit 5,5-fach über der Aktivität der Kontrollblätter. Nicht nur in dem direkt befressenen Blattgewebe, sondern auch in dem Blattgewebe benachbarter, ungeschädigter Blätter vergrößerte sich die PI-Aktivität 3,6-fach, so daß aufgrund eines systemischen Effekts eine Aktivierung in noch nicht geschädigtem Gewebe erfolgte.

Kon

PI-Aktivität [µg PI mg-1 Protein g-1 FW]

0

Abb. 30: Auswirkungen verschiedener Behandlungsweisen auf die Aktivität von Proteinaseinhibi-toren (PI) im Blattgewebe von Alnus glutinosa. Dargestellt sind die PI-Aktivitäten [µg PI mg^-1 Protein g^-1 FW] ungeschädigter Blätter (Kontrolle), nach Herbivorenfraß von Agelastica alni-Larven sowie die systemische Induktion in benachbarten, unbefressenen Blättern (A. alni, syst.), nach Inkubation mit den Signalstoffen (Jasmonsäure (JA), Salicylsäure (SA), Ethylen, Methyljasmonat (MeJA) und Methylsalicylat (MeSA). Die PI-Aktivitätsbestimmung erfolgte nach 72-stündiger Inkubation mit dem Radialdiffusionsassay mit Trypsin als Proteinase. Angegeben sind der Mittelwert und der Standardfehler.

ANOVA (F = 18,91, p < 0,001, n = 64). Verschiedene Buchstaben zeigen signifikante Unterschiede (p <

0,05, Newman Keuls-Test) an. FW = Frischgewicht.

Der Signalstoff Jasmonsäure vermehrte die Aktivität der Proteinaseinhibitoren signifi-kant um den 3,4-fachen Wert (Abb. 30). Dieser Effekt konnte durch Salicylsäure, einer weiteren Signalsubstanz in der pflanzlichen Abwehr, nicht hervorgerufen werden. Die Inkubation der Erlenblätter mit den flüchtigen Signalstoffen Ethylen, Methyljasmonat und Methylsalicylat belegte nur für die beiden Verbindungen Ethylen und Methyljas-monat einen signifikant positiven Einfluß auf die Aktivität der Proteinaseinhibitoren:

Ethylen vergrößerte die Aktivität 4,3-fach und Methyljasmonat 3,7-fach.

Methylsalicylat wirkte sich nicht auf die Aktivität der Proteinaseinhibitoren im Blatt-gewebe aus. Weiterhin wurden aus dem fraßinduzierten Erlenduftspektrum (Abb. 38) einzelne Duftstoffkomponenten, wie z.B. Methylanthranilat, cis-3-Hexenylacetat, Ocimen, Linalool, Caryophyllen, C11- (DMNT) und C16-Homoterpen (TMTT) bezüg-lich ihrer physiologischen Auswirkung auf die Aktivität der Proteinaseinhibitoren ge-testet. Die Resultate dieser Aktivitätsbestimmungen der Proteinaseinhibitoren sind in Abb. 31 dargestellt. PI-Aktivität [µg PI mg-1 Protein g-1 FW]

0

Abb. 31: Auswirkungen verschiedener Duftstoffe auf die Aktivität von Proteinaseinhibitoren (PI) im Blattgewebe von Alnus glutinosa. Dargestellt sind die PI-Aktivitäten [µg PI mg^-1 Protein g^-1 FW]

ungeschädigter Blätter (Kontrolle) und nach Inkubation mit verschiedenen Duftstoffen (Methylanthrani-lat, cis-3-Hexenylacetat, cis-Jasmon, Ocimen, Linalool, Caryophyllen, DMNT und TMTT. Die Aktivi-tätsbestimmung der PI erfolgte nach 72-stündiger Inkubation mit dem Radialdiffusionsassay mit Trypsin als Proteinase. Angegeben sind der Mittelwert und der Standardfehler. ANOVA (F = 53,66, p < 0,001, n

= 72). Verschiedene Buchstaben zeigen signifikante Unterschiede (p < 0,05, Newman Keuls-Test) an.

FW = Frischgewicht. DMNT = 4,8-Dimethylnona-1,3,7-trien (C11-Homoterpen). TMTT = 4,8,12-Tri-methyltrideca-1,3,7,11-tetraen (C16-Homoterpen).

Für die aromatische Verbindung Methylanthranilat, die aliphatische Verbindung cis-3-Hexenylacetat und für die beiden Terpene Linalool und Caryophyllen konnten keine signifikanten Effekte auf die Aktivitäten der Proteinaseinhibitoren nachgewiesen wer-den (Abb. 31). Hingegen veränderten cis-Jasmon, das Monoterpen Ocimen und die bei-den Homoterpene, das C11- und C16-Homoterpen, signifikant die Aktivität der Proteina-seinhibitoren. Dabei beeinflußte cis-Jasmon die Aktivität der Proteinaseinhibitoren am stärksten: Es konnte eine Aktivität der Proteinaseinhibitoren von 53,18 ± 3,99 µg mg^-1 Protein g^-1 FW bestimmt werden, die 14,1-fach über der der unbehandelten Blätter lag.

Die Effekte des Monoterpens Ocimen und die des C11-Homoterpens erreichten nicht dieses Ausmaß. Ocimen vergrößerte die Aktivität der Proteinaseinhibitoren 8,9-fach und das C11-Homoterpen 7,8-fach. Der Einfluß des C16-Homoterpens war etwa nur halb so groß wie der des Ocimens. Es bewirkte eine 4,7-fache Veränderung der Aktivität der Proteinaseinhibitoren (Abb. 31).

5.2.2 „Containerversuche“

flüchtige Signalstoffe

Kontrolle K-Nachbar A. alni A-Nachbar

Container 1 Container 2

Abb. 32: Schematische Darstellung zur Versuchsanordnung der Containerversuche. In einem Glas-gefäß befand sich ein Erlentrieb, der mit Larven von Agelastica alni besetzt war („A. alni“). Um den fraßinduzierten Trieb wurde eine befallsfreie Pflanze „A-Nachbar“ plaziert, so daß emittierte Duftstoffe ungehindert über den Gasraum zu den ungeschädigten Blättern gelangen konnten. Ein weiterer Glascon-tainer mit gleichem Versuchsaufbau, aber ohne Larvenfraß, diente als Kontrolle.

Kann eine befallene Pflanze mit einer benachbarten, befallsfreien Pflanze kommunizie-ren und sie veranlassen, ihre Abwehrmechanismen zu aktiviekommunizie-ren? Dieser Frage wurde mit Containerversuchen (Kap. 4.4.1.2) nachgegangen, die schematisch in Abb. 32 dar-gestellt sind. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden die Phenolgehalte, die Aktivität oxi-dativer Enzyme (Polyphenoloxidase, Peroxidase und Lipoxygenase) sowie die von Proteinaseinhibitoren untersucht. Über Fraßwahlversuche mit A. alni-Larven wurden Veränderungen der Blattqualität überprüft.

5.2.2.1 Phenolgehalte

Die Untersuchungen der Auswirkungen fraßinduzierter Duftstoffe auf unverletztes Blattgewebe erbrachten quantitative Veränderungen der Blattphenolmenge. Diese er-höhte sich in den benachbarten, nicht befallenen Blättern nach 72-stündiger Inkubation in den Containern signifikant 1,5-fach (Abb. 33, Tab. 12). Ein solcher Effekt war weder nach kurzzeitiger Inkubation noch nach 24- oder 48-stündiger Inkubation feststellbar gewesen (Abb. 33, Tab. 12).

Phenolgehalt DW -1 [mg g-1 ]

Abb. 33: Auswirkungen fraßinduzierter Duftstoffe auf den Phenolgehalt DW^-1 [mg g^-1] ungeschä-digter Alnus glutinosa-Blätter. Dargestellt ist der zeitliche Verlauf (t = 3; 6; 12; 24; 48; 72 h) der Aus-wirkungen fraßinduzierter Duftstoffe geschädigter A. glutinosa-Blätter (A = Herbivorenfraß von Age-lastica alni-Larven) auf den Phenolgehalt im Blattgewebe ungeschädigter, benachbarter Blätter (AN). Als Kontrolle dienten unbefallene Blätter (K) und ungeschädigte, benachbarte Blätter (KN). Der Phenolgehalt DW^-1[mg g^-1] wurde zu den angegebenen Zeitpunkten t [h] photometrisch bestimmt. Angegeben sind der Mittelwert und der Standardfehler. DW = Trockengewicht. Die statistischen Daten des gepaarten t-Tests sind Tab. 12 zu entnehmen. n.s. = nicht signifikant. *** = p < 0,001.

Tab. 12: Auswirkungen fraßinduzierter Duftstoffe auf den Phenolgehalt DW^-1 [mg g^-1] ungeschä-digter Alnus glutinosa-Blätter. Vergleich von „Kontrolle“ und „K-Nachbar“ vs. „A-Nachbar“ zu den angegebenen Inkubationszeiten. Die statistischen Werte wurden mit Hilfe des gepaarten t-Tests berechnet. Die grafische Darstellung der Daten ist in Abb. 33 wiedergegeben.

Zeitpunkt t p n

PPO-Aktivität [∆E490 min-1mg-1Protein]

POD-Aktivität [∆E470 min-1mg-1Protein] LOX-Aktivität [∆E234 min-1mg-1Protein]

0

Als Folge der 48-stündigen Inkubation mit fraßinduzierten Duftstoffen wurde eine er-höhte Enzymaktivität der untersuchten Enzyme Polyphenoloxidase, Peroxidase und Lipoxygenase in den benachbarten, nicht befallenen Blättern festgestellt, deren Verän-derungen in der nachfolgenden Abbildung (Abb. 34) grafisch dargestellt sind. Die En-zymaktivität veränderte sich um das 3,2-fache bei den Polyphenoloxidasen, um das 2,6-fache bei Lipoxygenasen und um das 4,7-2,6-fache bei Peroxidasen.

Abb. 34: Auswirkungen fraßinduzierter Duftstoffe auf die Aktivi-tät oxidativer Enzyme im Blattgewebe von ungeschädigten Alnus glutinosa-Blättern. Dargestellt ist der Einfluß fraßinduzierter Duft-stoffe geschädigter A. glutinosa-Blätter (A = Herbivorenfraß von Age-lastica alni-Larven) auf die Aktivität oxidativer Enzyme im Blattgewebe ungeschädigter, benachbarter Blätter (AN). Als Kontrolle dienten unbefallene Blätter (K) und ungeschädigte, benachbarte Blätter (KN).

Die Aktivität der Enzyme wurde nach 72-stündiger Inkubation in den Containern photometrisch be-stimmt. Angegeben sind der Mittelwert und der Standardfehler. - a) Polyphenoloxidase-Aktivität (PPO) [∆E490 min^-1 mg^-1 Protein]. - b) Peroxidase-Aktivität (POD) [∆E470 min^-1 mg^-1 Protein]. - c) Lipoxygenase-Aktivität (LOX) [∆E234 min^-1 mg^-1 Protein]. Die statistischen Daten des gepaarten t-Tests sind Tab. 13 zu entnehmen. *** = p < 0,001.

Tab. 13: Auswirkungen fraßinduzierter Duftstoffe auf die Aktivität oxidativer Enzyme im Blattge-webe von ungeschädigten Alnus glutinosa-Blättern. Vergleich von „Kontrolle“ und „K-Nachbar“ vs.

„A-Nachbar“. Die statistischen Werte wurden mit Hilfe des gepaarten t-Tests berechnet. Die grafische Darstellung der Daten ist in Abb. 34 wiedergegeben.

untersuchtes Enzym t p n

PPO-Aktivität -7,79 < 0,001 27 POD-Aktivität -8,50 < 0,001 27 LOX-Aktivität -8,91 < 0,001 27

PI-Aktivität [µg PI mg-1 Protein g-1 FW]

Kon K-Nachbar A. alni A-Nachbar

***

5.2.2.3 Proteinaseinhibitoraktivitäten

Die quantitative Bestimmung der Aktivität der Proteinaseinhibitoren in den A. glutinosa-Blättern erfolgte nach 72-stündiger Inkubation in den Glascontainern und wurde mittels des Radialdiffusionsassays ermittelt. Die ermittelten Werte der Aktivität der Proteinaseinhibitoren der unterschiedlich behandelten Blätter sind in Abb. 35 darge-stellt.

Abb. 35: Auswirkungen fraßinduzier-ter Duftstoffe auf die Aktivität von Proteinaseinhibitoren (PI) im Blattge-webe von Alnus glutinosa-Blättern.

Dargestellt ist der Einfluß fraßinduzierter Duftstoffe geschädigter A. glutinosa-Blätter (A. alni) auf die Aktivität von PI im Blattgewebe ungeschädigter, benachbarter Blätter (A-Nachbar). Als Kontrolle dienten unbefallene Blätter (Kon) und ungeschädigte, benachbarte Blätter (K-Nachbar). Die PI-Aktivität wurde nach 72-stündiger Inkubation in den Containern mit dem Radialdiffusionsassay mit Trypsin als Proteinase bestimmt.

Angegeben sind der Mittelwert und der Standardfehler. Die statistische Auswertung erfolgte mit einem gepaarten t-Test. „Kontrolle“ und „K-Nachbar“ vs. „A-Nachbar“: t = 3,12, p = 0,0065, n = 18. *** = p <

0,001.

Die Blätter der unbehandelten Erlentriebe wiesen eine PI-Aktivität von 3,68 ± 1,05 µg PI mg^-1 Protein g^–1 FW („Kontrolle“) und von 3,65 ± 0,71 µg PI mg^-1 Protein g^–1 FW („K-Nachbar“) auf, wobei sich die PI-Aktivität nicht signifikant zwischen „Kontrolle“

und „K-Nachbar“ unterschied. Durch Herbivorenfraß stieg die PI-Aktivität der „A.

alni“-Blätter um den Faktor 2,8 signifikant auf 10,32 ± 1,12 µg PI mg^-1 Protein g^–1 FW an und unter dem Einfluß dieser befressenen, induzierten Blätter vergrößerte sich in den benachbarten Blättern „A-Nachbar“ die PI-Aktivität 1,9-fach (6,84 ± 0,61 µg PI mg^-1 Protein g^–1 FW) („Kontrolle“ und „K-Nachbar“ vs. „A-Nachbar“: t = 3,12, n = 18, p <

0,0065).