The Proteasome

1.7 The Proteasome 

The ubiquitin‐proteasome‐system (UPS) is the major mechanism of eukaryotic cells to degrade  proteins in order to maintain protein homeostasis. The centre of the pathway is the 26S  proteasome, a multi‐subunit ATP‐dependent complex degrading ubiquitinated proteins not  only in the cytoplasm but also in the nucleus. It consists of a 20S core particle (CP) cleaving its  substrates endocatalytically and 19S regulatory particles (RP, PA700) which can associate at  both sites to control the entry of the substrates (Figure 3). The 20S proteasome is found in  Bacteria, Archaea and Eukarya and its overall structure is well conserved. It consists of four  stacked heptameric rings forming a barrel‐like shape with a central pore divided into three  chambers (Lowe, Stock et al. 1995, Groll, Ditzel et al. 1997). In eukaryotes the outer rings are  composed  of  seven  different ‐subunits,  the inner rings  of  seven  different ‐subunits  including the three catalytically active ones with N‐terminal threonine residues as active‐site 

nucleophiles. Those subunits favour different amino acids as signal for hydrolysis of peptide  bonds. 1 (PSMB6, Y, ) comprises a caspase‐like activity cleaving after acidic amino acids, 2  (PSMB7, Z, MC14) has a trypsin‐like activity preferring basic amino acids and 5 (PSMB5, X,  MB1) bares a chymotrypsin‐like activity choosing hydrophobic residues. 

Proteasomes are the main proteases supplying ligands for major histocompatibility complex  (MHC) class I molecules as they produce peptides of eight to ten amino acids in length with  preferentially  hydrophobic  or basic  amino acids  at the C‐terminus  as  anchor residues  particularly fitting into the cleft of the MHC molecules. 

The  transcription  factor  nuclear  factor  erythroid  2‐related  factor  (Nrf)  1  is  a  type  II 

the proteasome. Upon impaired proteasome function Nrf1 is only partially processed and  thereby activated. It increases the transcription of all proteasome subunits and PA200 as well  as VCP and its cofactors Ufd1, Npl4 and p47 (see section 1.9) to compensate the reduced  degradation capacity (Sha and Goldberg 2014). 

Figure 3: Scheme of the 26S proteasome. The 20S core particle consists of four heptameric rings stacked onto  each other. The outer rings are built of ‐subunits and the inner rings are comprised of ‐subunits including  the catalytically active ones 1, 2 and 5. The 19S regulatory particle contains the AAA subunits Rpt1‐6 which  build together with Rpn1, 2 and 13 the base for the assembly of the subunits Rpn3, 5‐9, 11, 12 and 15 which  form a lid. The 19S particle regulates the entry of substrates into the catalytic chamber of the core particle. 

1.7.1. Proteasome Activators 

The ‐subunits of the 20S CP confine the entry of the substrate into the pore by building a  gate which can be opened through conformational changes caused by binding of the 19S RP  or the other proteasome activators (PA) 11S RP (PA28) or Blm10 (PA200). This gains the access  of substrates which need to be degraded and restricts uncontrolled proteolysis (reviewed in  (Forster, Unverdorben et al. 2013)). 

The base of the 19S RP is composed of regulatory‐particle triple‐A proteins (Rpt) 1‐6 forming  a ring and the regulatory particle non‐ATPase proteins (Rpn) 1, 2 and 13. The subunits Rpn 3,  5‐9, 11, 12 and 15 form a lid which is connected to the base via Rpn10 (Figure 3). The C‐termini 

of the Rpt subunits extend into pockets between the ‐subunits of the 20S CP and the N‐

termini of the‐subunits are arranged at the inside of the RP ring (reviewed in (Kunjappu and  Hochstrasser 2014)). Ubiquitin chains attached to substrates are recognized by the receptor  subunits Rpn10 and Rpn13 so that the substrate can be grasped by the Rpt subunits to  translocate the protein through the ring which is ATP‐dependent and thereby unfold it. In the  meantime the deubiquitinating enzyme Rpn11 removes the ubiquitin chain from the substrate  which then can enter the cylinder of the 20S CP and reach the middle chamber where the  cleavage of the substrate occurs (Verma, Aravind et al. 2002). The ubiquitin chain can be  further processed and the single moieties can be reused for conjugation. 

The other two proteasome activators PA28 and PA200 bind to the ‐ring of the 20S CP the  same way as the 19S RP in order to open the gate but in an ATP‐independent manner. The  activators can also combine with the 19S RP to build a hybrid proteasome (Hendil, Khan et al. 

1998, Cascio, Call et al. 2002). PA200 is a 250 kDa monomer which was indicated to activate  the proteasome during in DNA repair and spermatogenesis by stimulating the caspase‐like  activity of the 20S CP (reviewed in (Savulescu and Glickman 2011)). PA28is a subtype of PA28  mainly expressed in the nucleus forming a homoheptameric ring. It was shown to selectively  stimulate the trypsin‐like activity without affecting the other two activities and to promote 

ubiquitin‐independent degradation of some substrates involved in cell cycle progression and  induction of apoptosis. The other subtype of PA28 is the heteroheptamer PA28 3  and 4 

 subunits, whose expression is induced by the cytokine IFN, assemble to form a ring which  associates with the 20S proteasome in the cytosol. PA28 is involved in the MHC I restricted  antigen presentation as it enhances processing of small peptides resulting in MHC I ligands  (reviewed in  (Vigneron and  Van den Eynde 2014)).  This relates  to double‐cleavage  of  substrates presumably by retention of the substrates in the catalytic chamber (Dick, Ruppert  et al. 1996). Accordingly it was demonstrated that PA28 promotes presentation of virus  antigens leading to an increased recognition by T‐cells (Groettrup, Ruppert et al. 1995). 

1.7.2. The immunoproteasome 

As response to an infection the proinflammatory cytokine IFN is produced which in turn  triggers a lot of reactions to fight pathogens. One of those downstream effects is the induction  of proteasome subunits which substitute the catalytically active subunits in newly assembled  proteasomes.  

In the so called immunoproteasome the subunits 1 and 5 are replaced by low‐molecular  mass peptide 2 (LMP2 or 1i) and LMP7 (5i), respectively, which are encoded in the MHC 

class II locus (Brown, Driscoll et al. 1991, Glynne, Powis et al. 1991, Kelly, Powis et al. 1991,  Ortiz‐Navarrete, Seelig et al. 1991). 2 is exchanged by multicatalytic endopeptidase complex  like‐1 (MECL‐1 or 2i), which is not encoded in the MHC (Boes, Hengel et al. 1994, Groettrup,  Kraft et al. 1996, Hisamatsu, Shimbara et al. 1996). 

Because of the altered cleavage specificities of the immunoproteasome, meaning a lower  caspase‐like activity and higher chymotrypsin‐like activity, a different subset of MHC I ligands  is produced (Gaczynska, Rock et al. 1994). Ligands with hydrophobic amino acids at their C‐

terminus have a higher affinity to the cleft of the MHC I molecules. Thus these peptides are  preferentially presented on the cell surface which leads to the activation of a different T‐cell  repertoire (Fehling, Swat et al. 1994, Van Kaer, Ashton‐Rickardt et al. 1994, Chen, Norbury et  al. 2001, Basler, Youhnovski et al. 2004). As the peptides are often derived from viral or  tumour proteins a more efficient immune response is initiated. In return primarily the  constitutive proteasome is capable to  produce  antigenic peptides resulting from some  proteins (Chapiro, Claverol et al. 2006). In experiments using knockout (KO) mice and  inhibitors of the inducible subunits it became clear that not only the cleavage specificity but  sometimes just their presence is needed for proper antigen presentation by protecting  peptides from cleavage by the constitutive proteasome (Basler, Lauer et al. 2012). Not only  the generation of antigens for presentation but also the production of inflammatory cytokines  is changed. This is an important observation for the therapy of autoimmune diseases, which  can be ameliorated by treatment with specific immunoproteasome inhibitors (Muchamuel,  Basler et al. 2009, Basler, Dajee et al. 2010, Basler, Mundt et al. 2014). 

As mentioned above the immunoproteasome subunits are only incorporated into newly  assembled proteasomes interdependently. Therefore mainly immunoproteasomes containing 

all three inducible subunits are built (Groettrup, Standera et al. 1997, Griffin, Nandi et al. 

1998). But there are exceptions leading to intermediate proteasomes containing 1, 2 and 

5i (Dahlmann, Ruppert et al. 2000, Guillaume, Chapiro et al. 2010). This might give rise to a  greater variety of peptides for presentation on MHC I molecules. 

In normal body cells the presence of immunoproteasomes is tightly regulated as they have a  much shorter half‐life than constitutive proteasomes (Heink, Ludwig et al. 2005), whereas in  cells of the lymphoid tissues such as thymus, spleen and lymph nodes immunoproteasomes  are permanently expressed (Stohwasser, Standera et al. 1997). In cortical thymic epithelial 

cells a third type of proteasome is expressed, the thymoproteasome with the catalytic subunit 

5t, which is important for positive selection of T‐cells (Murata, Sasaki et al. 2007).  

1.7.3. Proteasome inhibitors 

In order to study the role of the proteasome in various cellular processes previous known  protease inhibitors were adopted. Depending on the structure of the peptide aldehyde  leupeptin,  inhibitors  with  higher  potency  and  increased  selectivity  towards  the  20S  proteasome were developed, e.g. MG115 and MG132 (Rock, Gramm et al. 1994). To increase  selectivity further other classes of molecules, like epoxyketones, e.g. the natural compound  epoxomycin, or boronic ester derivatives, were refined. Belonging to the latter, the compound  MG‐341 (PS‐341 and later Bortezomib) was found to be a reversible inhibitor of the 20S  proteasome. Under the trade name Velcade® it is intensively applied for treatment of Multiple  Myeloma. Because of reduced resistance and relapse rates, also Carfilzomib (Kyprolis®) is now  used as treatment. However, because of the massive side effects of the available drugs, there  is still need for design of more selective compounds (reviewed in (Dou and Zonder 2014)).  

The immunoproteasome was identified as valuable target for treatment of haematological  malignancies and autoimmune diseases. For example the LMP7 selective inhibitor ONX‐0914  (PR‐957) was successfully implemented in mouse models for treatment of experimental  arthritis (Muchamuel, Basler et al. 2009), experimental colitis (Basler, Dajee et al. 2010), and  experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)(Basler, Mundt et al. 2014).