1 Candida albicans als Humanpathogen – Epidemiologie und Therapie
4.2 Protease-Assays mit heterolog exprimiertem Rbe1p und Rbt4p
ORF19.13583 (RBT4) QQILDAHNQKRARHGVPDLTWDATVYQYAQKFADQ-YSCSGN-LQHSGGKYGENLAVGYA 270 ORF19.2336 ELMLKEHNNKRKLHQSCPLKWSSELFNYASQFAAE-YSCSGI-LQHSGGKYGENLAFGYS 120 ORF19.7218 (RBE1) EEILKEHNVKRALHGVPALSWSNKLAEYAQDYANTGFDCSNLNLKHSGGPYGENLAAGYM 184 ORF19.6200 RQILEAHNIKRASHGVNPLTWSNELYNYANKVASS-YDCSGN-LRHTSGPYGENLALGYS 241 ORF19.2787 SEILDAHNKYRAQHKVGDLSWDVDTYNYAKNNADN-YDCSGV-LTHTHGKFGENLAAGFK 358 :*. ** * * *.*. :**.. * :.**. * *: * :***** *:
ORF19.13583 (RBT4) DGAAALQAWYEEAGKDGLSYSYGSSSVYNHFTQVVWKSTTKLGCAYKDCRAQN--WGLYV 328 ORF19.2336 P-IGAIEAWYDE----GEMYVYGSENVYNHFTAIVWNNTNSLGCAYKSCDTTTNLNALYI 175 ORF19.7218 (RBE1) GGISPVDAWYDEISMVDWNNVDFTESTG-HFTQLVWRSTTQVGCAKMMCSTAWR---QIT 240 ORF19.6200 SGANAVSAWYSEG---FNFGGAGKLNHFTQVVWKSTTQLGCAYKDCRAKG--WGLYI 293 ORF19.2787 DGASTVAAWVDEP---ISYSDASFVYNHFTQVIWKGSTKVGCAYKDCRKSN--WGLYV 411 .: ** .* *** ::*..:..:*** *
ORF19.13583 (RBT4) VCSYDPAGNVMGTDPKTGKSYMAENVLRPQ- 358 ORF19.2336 VCSYYPPGNVIGYSSQNVFPLNSKMVN---- 202 ORF19.7218 (RBE1) VCEYLPRGNVIGLNVTSGHSYFVDNVLPPLK 271 ORF19.6200 ICNYQKPGNIIGQELANILPLIRS--- 317 ORF19.2787 VCEYDPYGNVIGQGSKNVFP--- 431 :*.* **::* . .
Aufgrund der signifikanten Homologien von Tex31p zu den Mitgliedern der Pry-Familie in C. albicans und der Konservierung der vorgeschlagenen katalytischen Triade aus 3 Aminosäuren in allen 5 Pry-Proteinen in C. albicans, wurden die beiden Proteine Rbe1p und Rbt4p auf eine mögliche Funktion als Protease hin untersucht. Zu diesem Zweck wurden beide Proteine heterolog in S. cerevisiae exprimiert und anschließend aufgereinigt.
Heterologe Expression von Rbe1p und Rbt4p in S. cerevisiae
Die Gene RBE1 und RBT4 wurden für die Expression in S. cerevisiae ohne Stop-Kodon über die Restriktionsschnittstellen BamHI und XhoI in das Plasmid pYES2/CT (Invitrogen) ligiert.
Bei der Expression und Translation in S. cerevisiae werden so Fusionsproteine gebildet, die an ihrem C-Terminus ein virales V5-Epitop (GKPIPNPLLGLDST), sowie ein sechsfaches Histidin-Epitop zum immunologischen Nachweis bzw. für die Aufreinigung mittels Affinitätschromatographie tragen.
In S. cerevisiae ist die Expression der Fusionsproteine durch die Zugabe von Galaktose als Kohlenstoffquelle zum Medium induzierbar, da die Gene der betreffenden Fusionsproteine in dem für die Expression verwendeten Plasmid unter der regulatorischen Kontrolle des GAL1-Promotors stehen (Abb. 42).
Abb. 41. Sequenzvergleich der Proteine Rbt4p (ORF19.13583), ORF19.2336, Rbe1p (ORF19.7218), ORF19.6200 und ORF19.2787 von Candida albicans (Ausschnitt). Erstellt mit Hilfe des Programmes
„ClustalW2“ (Larkin et al., 2007); „*” = identische AS in allen Sequenzen, „:“ = konservierte Substitutionen, „.“ = semi-konservierte Substitutionen; fettgedruckt: CAP-Domäne von Rbe1p; rot hervorgehoben: vorgeschlagene katalyt. Aminosäuren für die Spaltung basischer Peptide.
Um festzustellen, in welcher Fraktion der Induktionskulturen sich der Hauptteil der Fusionsproteine befindet, wurden zunächst die löslichen Proteine aus dem Zytosol der S.
cerevisiae-Zellen sowie die Überstände induzierter und nicht-induzierter Kulturen immunologisch durch Western Blot-Analyse mit Hilfe eines Antikörpers gegen das V5-Epitop auf die Anwesenheit der Fusionsproteine hin untersucht (Abb. 43).
Abb. 43. Heterologe Expression von Rbe1p und Rbt4p in S. cerevisiae. Western Blot-Analyse der Induktionskulturen; Induktion: 24 Stunden SC-Medium (mit (+) bzw. ohne (-) Galaktose, ohne Uracil, 30°C);
Entwicklung: V5-Antikörper; P: Kontrollstamm (pYES2/CT); „RBE1“, „RBT4“: pYES2/CT mit integriertem RBE1- bzw. RBT4-Gen
Abb. 42. Plasmide für die heterologe Expression von RBE1 und RBT4 in S.
cerevisiae. Karte des für die Expression verwendeten Plasmids (pYES2/CT, Invitrogen); die offenen Leserahmen der beiden Gene wurden ohne Stop-Kodon über die Restriktionsschnittstellen BamHI und XhoI in das Plasmid ligiert; dort stehen sie unter transkriptioneller Kontrolle des GAL1-Promotors und werden als Fusionsproteine mit einem V5-Epitop und einem 6-fachen His-Tag am C-Terminus exprimiert.
ORF (RBE1, RBT4)
BamHI - - XhoI
48.8 37.1 64.2
25.9 19.4 kDa
Zell-Extrakt Überstand
Galaktose
P P
+
P P
+
RBE1 RBT4
RBE1
RBE1
RBE1 RBT4
RBT4
RBT4
-
-Rbe1p-V5-6xHis Rbt4p-V5-6xHis
Der V5-Antikörper bindet nur an Proteine der mit Galaktose induzierten S. cerevisiae-Kulturen mit den RBE1- und RBT4-tragenden Plasmiden, nicht an Proteine des Kontrollstammes, welcher nur das „leere“ Plasmid trägt, noch an Proteine der nicht-induzierten Stämme. In den Proteinfraktionen der Überstände der Stämme mit den Expres-sionsplasmiden für rRbe1p und rRbt4p ist deutlich jeweils nur eine Bande zu erkennen. Das bedeutet, dass beide Proteine - wie in C. albicans (s.o.) - auch bei der Expression in S.
cerevisiae in das Medium sekretiert werden. Dies unterstützt die Daten der massenspektro-metrischen Analysen aus C. albicans, die ebenfalls auf eine Sekretion der beiden Proteine in den extrazellulären Bereich hinweisen (Tab. 22).
Die Bandengrößen der beiden Fusionsproteine im Gel ist mit etwa 70 kDa deutlich größer als vom Molekulargewicht der beiden Proteine zu erwarten (gereiftes Rbe1p (ohne Signalsequenz): 252 AS = 27,72 kDa, gereiftes Rbt4p: 339 AS = 37,29 kDa; Größe der beiden Epitope V5 und 6-fach His: etwa 2 kDa). In den zytosolischen Proteinfraktionen der Induktionskulturen sind zahlreiche Banden zu sehen. Diese entsprechen wahrscheinlich steady-state Produkten des Sekretionsweges bzw. N-terminal abgebauten Produkten.
Da beide Fusionsproteine in hinreichenden Mengen in den Überständen der induzierten Kulturen zu finden sind, wurden sie aus diesen mittels Nickel-Affinitätschromatographie aufgereinigt und gegen 50 mM Bis-Tris-Propan-Puffer dialysiert. Die Fraktionen der Chromatographie wurden mittels SDS-PAGE analysiert (Abb. 44).
Die Fraktionen der Elution (Abb. 44, E) zeigen jeweils eine starke Anreicherung des entsprechenden rekombinanten Fusionsproteins (Konzentration: etwa 10 ng/µl; entspricht bei einer Größe von 30 kDa = 0,3 µM) gegenüber den Überständen der Induktionskulturen (ÜS), bei denen die entsprechenden Banden bereits schwach zu erkennen sind. Die Bandengrößen der aufgereinigten Proteine entsprechen mit etwa 70 kDa denjenigen des Immunnachweises (Abb. 43). Die Bande von rRbe1p ist etwas diffus, was auf einen höheren Glykosylierungs-grad hinweisen kann und läuft bei einem etwas geringeren Molekulargewicht als diejenige von rRbt4p.
Abb. 44. Aufreinigung von rRbe1p und rRbt4p aus S. cerevisiae.
SDS-PAGE der Fraktionen nach Nickel-Affinitätschromatographie (Ni-NTA); SYPRO Ruby-Färbung;
L: Leiter, ÜS: Überstände der Induktionskulturen (= Input), D:
Durchfluss, E: Elutions-Fraktion 1 50
70 90 120
40 30 kDa
L ÜS D E ÜS D E
Rbe1p Rbt4p
Die auf diese Weise aufgereinigten Proteine wurden in Protease-Assays auf eine mögliche Protease-Funktion hin untersucht.
Protease-Assays
Die heterolog in S. cerevisiae exprimierten und aufgereinigten Proteine rRbe1p und rRbt4p wurden mit Hilfe eines Peptid-Arrays auf Protease-Aktivität hin untersucht. Dieser umfasst 360 Oligopeptide von 8 Aminosäuren Länge (75 pmol/well), die 2520 Protease-Spaltsequenzen repräsentieren (Protease Substrate Set, JPT Peptide Technologies, Berlin).
Die Oligopeptide tragen endständig ein Fluorophor (EDANS = 5-[(2-Aminoethyl)amino]
naphthalen-1 Sulfonsäure) und einen nicht-fluoreszierenden Quencher (Dabcyl = 4-[4-Dimethylamino-phenylazo-]benzoesäure). Fluoreszenz ist nur im Falle der proteolytischen Spaltung zu messen, da das Emissionsspektrum des Fluorophors EDANS (Emission: 490 nm) mit dem Absorptionsspektrum des Quenchers Dabcyl (Absorption: λmax=472 nm) stark überlappt. So wird die von EDANS emittierte Fluoreszenz bei großer räumlicher Nähe von Dabcyl absorbiert.
Für die Messung einer möglichen proteolytischen Aktivität von rRbe1p und rRbt4p wurden die Peptide des Peptid-Arrays auf zwei 384 well-Mikrotiterplatten verteilt und Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von 465 nm vor und nach Zugabe der rekombinanten Proteine rRbe1p und rRbt4p in einem Fluoreszenzplatten-Leser (TECAN SpectraFluor Plus) nach Inkubation bei 37°C über einen Zeitraum von 18 Stunden zu mehreren Zeitpunkten gemessen. Da Tex31p als Calcium-abhängige Protease beschrieben wurde, wurden bei den Ansätzen die in der Literatur beschriebenen Reaktionsbedingungen verwendet (100 mM Bis-Tris-Propan-Puffer, 1 mM CaCl2). Relative Fluoreszenzwerte für die einzelnen Spaltansätze wurden anhand der Differenz der Werte nach und vor Zugabe der Proteine gebildet und graphisch dargestellt (Abb. 45 für eine Inkubation von 2,5 Stunden).
Nach Inkubation der rekombinanten Proteine mit der Peptid-Bibliothek sind zu allen gemessenen Zeitpunkten signifikante Fluoreszenzwerte für beide rekombinanten Proteine in einzelnen Spaltansätzen der Mikrotiterplatte zu detektieren (stärkste relative Fluoreszenzwerte rRbe1p: N3, G11, L17; Rrbt4p: F11). Dies würde man für sequenzspezifische Proteasen erwarten, da diese hochselektiv nur wenige Sequenzen erkennen und prozessieren. Ein di-basisches Aminosäuremotiv, welches typisch für die Spaltstelle von Pro-Hormonen wie auch
1 4 7 10 13 16 19 22 A D G JMP -30000
-20000 -10000 0 10000 20000 30000 40000 50000
rRbe1p
N3
G11 L17
F11
N3 = AKRRTKRD G11 = YVKASELP L17 = LGPRIVNG
F11 = DRHDSGLD
Abb. 45. Protease-Assays für rRbe1p (A) und rRbt4p (B). Relative Fluoreszenzwerte (y-Achse) in den einzelnen Gefäßen der 384 well-Mikrotiterplatten (24 x 16) nach Zufügen der rekombinanten Proteine und Inkubation für 2,5 Stunden bei 37°C; N3, G11, L17, F11: Koordinaten der wellsmit der höchsten relativen Fluoreszenz und die entsprechenden Sequenzen der darin enthalten Oligopeptide.
A
B
1 4 7
10 13 16
19 22 A D GJM P -40000
-30000 -20000 -10000 0 10000 20000 30000 40000 50000
# well
rRbt4p
F11
der Vorstufen der Conotoxine ist, findet sich bei Peptid N3 in Form der Aminosäuren Lysin-Arginin (KR). Dies zeigt auch die stärkste relative Fluoreszenz nach Zugabe rekombinanten Rbe1ps. Bei den übrigen Peptiden findet sich jeweils nur eine basische Aminosäure (Lysin (K) bzw. Arginin (R)) und diese sind in ihrer Gesamtzusammensetzung nur schwach basisch bzw. neutral. Die regelmäßig auftretenden Fluoreszenzwerte in Reihe 24 der Mikrotiterplatte bei Zugabe von rRbt4p (Abb. 45B, Reihe 24) sind möglicherweise auf eine Protease-Kontamination der verwendeten Pipettenspitzen zurückzuführen.
Spaltungsversuche
Drei der Peptide, bei denen sich die stärksten Fluoreszenzwerte nach Inkubation mit rRbe1p zeigten (N3, G11 und L17) und eines aus dem Ansatz mit rRbt4p (F11) wurden ohne Modifikationen de novo synthetisiert (Thermo Fisher Scientific, Ulm) und in unabhängigen Experimenten für Spaltungsversuche verwendet. Ziel dieser Versuche war es, die Ergebnisse der Peptid-Arrays zu bestätigen. Dafür wurden verschiedene Mengen der Peptide mit verschiedenen Mengen der rekombinanten Proteine in 100 mM BisTrisPropan-Puffer/1 mM CaCl2 inkubiert. Unter diesen Bedingungen waren auch die Protease-Assays mit Hilfe des Peptid-Arrays (s.o.) durchgeführt worden. Die dabei entstandenen Spaltprodukte sollten mit verschiedenen Methoden nachgewiesen werden
Zunächst wurde die Spaltansätze direkt massenspektrometrisch analysiert (Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Tandem Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF/TOFMS); Ultraflex II TOF/TOF, Bruker Daltonics). In den Spaltansätzen ließen sich auf diese Weise jedoch keine Spaltprodukte nachweisen (Daten nicht gezeigt).
Um die Reinheit der Spaltprodukte zu erhöhen, wurden bis zu 1 µmol Peptid mit 15 nmol rekombinantem Rbe1p bzw. Rbt4p bei 37°C über Nacht inkubiert und anschließend mittels reversed phase HPLC fraktioniert. Fraktionen, die eine deutliche Absorption im UV-Spektro-gramm zeigten, wurden anschließend wiederum massenspektrometrisch untersucht. Auch hier ließen sich keine spezifischen Spaltprodukte in den verschiedenen Ansätzen nachweisen (Daten nicht gezeigt).
Insgesamt zeigen die Protease-Experimente kein konsistentes Bild. Zusammenfassend deuten daher die hier durchgeführten Untersuchungen nicht eindeutig auf eine molekulare Funktion der beiden Pry-Proteine Rbe1p und Rbt4p als Proteasen hin.