Probenpräparation

4.4µm

2.6µm

Abb. 3.4: REM-Bild der großen und kleinen Partikel mit den daraus erhaltenen Durchmessern

3.2 Probenpräparation

3.2.1 Die Suspension

Die verwendeten Kolloidpartikel der Firma Dynal wurden in Suspension (große Partikel) oder trocken (kleine Partikel) geliefert. Als Ausgangspunkt diente bei den großen Partikeln die Stammsuspension, die kleinen wurden in autoklaviertes und deionisiertes Wasser (Mil-lipore-H2O) gegeben. Um die Suspension möglichst wenig zu verunreinigen, wurden die Partikel vorher nicht abgewogen, weshalb die Konzentration nicht bekannt war. Die Her-stellung der Suspension erfolgte in der Flow-Box, um eine Verunreinigung mit Fremdpar-tikeln möglichst gering zu halten. Obwohl die Strömungsverhältnisse in der Flow-Box sich später als nicht optimal herausstellten, waren die Bedingungen in der Box deutlich besser als außerhalb.

Um die Partikel für eine Messung aufzubereiten, wurde wie folgt eine Suspension herge-stellt:

- ca. 17 mg SDS (Natriumdodecylsulfat)

- ca. 7.8 ml autoklaviertem Millipore- oder Bidest-H2O - 100 µl Thimerosal

- 20 µl große Partikel aus der Stammsuspension (typischerweise) - 5 µl kleine Partikel (typischerweise)

- 200 µl Antibiotika

32 Kapitel 3 – Das Experiment Es ergab keinen Unterschied, ob man nun Millipore-H2O oder ein zweifach destilliertes Wasser (Bidest- H2O) verwendete. Das SDS dient zur sterischen Stabilisation sowohl der Partikel untereinander als auch zwischen den Partikeln und dem Polymerfilm auf dem Glassubstrat. Dabei wurde darauf geachtet, die Konzentration unter der kritischen Mizel-lenkonzentration (cmc) von 2.3 mg/ml zu halten. Ab dieser Konzentration bilden die SDS-Moleküle Mizellen, die zu einer Trübung der Suspension und somit zu Problemen bei der Partikelerkennung führen. Außerdem liegen die Mizellen in der Größenordnung der Kol-loid-Partikel, so dass nicht mehr nur von einer binären Kolloid-Suspension ausgegangen werden kann [Bub97]. Thimerosal wurde als eine Art Konservierungsstoff verwendet; es ist eine Quecksilberverbindung und ein gut wasserlösliches Nervengift [Thi96].

Je nach Suspension wurden auch andere Volumina der verschiedenen Partikel hinzugege-ben, um andere Konzentrationsverhältnisse auszuprobieren. Der oben genannte Wert er-wies sich für die meisten Messungen als sinnvoll.

Die Suspension wurde vor ihrer Verwendung für mindestens 12 Stunden in einer speziellen Vorrichtung im Ultraschallbad geschüttelt, um eine optimale Durchmischung und eine gute sterische Stabilisierung der Kolloidpartikel zu erreichen. Dabei erwärmte sich das Wasser im Ultraschallbad - also auch die Suspension - auf ca. 70°C. Im Laufe dieser Arbeit stellte sich heraus, dass es günstiger ist, die Antibiotika erst dann in die Suspension zu geben, wenn diese wieder auf unter 40°C abgekühlt ist, weil die Antibiotika bei höheren Tempera-turen zerstört werden. Das erklärt, warum die ersten Messzellen sehr schnell viele Bakteri-en Bakteri-enthieltBakteri-en und für die MessungBakteri-en unbrauchbar wurdBakteri-en. Bei der Antibiotika-Mischung handelte es sich um eine Fertigmischung von 100 I.E. Penicillin (Anm.: I.E. steht für inter-nationale Einheiten. 40000 I.E.=1mg [Rei97]) und 100 µg Streptomycin pro Milliliter.

Diese wurde in der Verdünnung 1:100 verwendet. Dazu kam noch Amphotericin B (25µg/ml) auch im Verhältnis 1:100 [[Str03], [Amp99], [Sig02]]. Diese Zusammenstellung ist eine sehr wirksame Mischung aus Fungiziden und Bakterioziden. Damit waren Experi-mentierzeiten von 14 Tagen möglich.

Die so hergestellte Suspension musste meist noch aufkonzentriert werden, um optimale Partikelkonzentrationen zu erreichen. Im Kühlschrank konnte die Suspension einige Wo-chen aufbewahrt und zur Herstellung weiterer Messzellen verwendet werden.

3.2.2 Die Messzelle

Für die Herstellung der Messzelle wurde der bewährte Prozess von K. Mangold übernom-men und nur leicht abgeändert.

Als Grundlage dient ein 0.5mm dickes und 20x20mm großes Glasplättchen. Dieses wird mittels Snowjet und Plasmacleaner gereinigt, bevor mit der Spincoating-Technik ein dün-ner PMMA-Film (Polymethylmethacrylat) aufgebracht wird. Das PMMA wird in eidün-ner Konzentration von 10% Wt in Essigsäure verwendet. Dieser Polymerfilm ist nötig, weil die Oberflächenrauhigkeit des Glasplättchens zu groß ist und die Partikeldiffusion in x-y-Ebene undefiniert beeinflussen würde [Bub02]. Um eingeschränkte Geometrien mit harten Wänden zu erhalten, wird ein TEM-Netzchen in den PMMA-Film gedrückt. Da die Erwei-chungstemperatur von PMMA bei 80-130°C und die Zersetzungstemperatur bei 170-330°C liegt [PMM95], wird das Glasplättchen mit Film nur kurz auf 150°C erwärmt und in der Zeit das Netzchen aufgebracht.

Damit das Netzchen noch besser in den PMMA-Film einsinken kann, wird das so präpa-rierte Glasplättchen mindestens 4 Tage in einen 60°C heißen Ofen gelegt. Um das restliche

3.2 Probenpräparation 33 Lösungsmittel besser aus dem PMMA-Film zu bekommen, wird im Ofen ein Vakuum erzeugt. Es stellte sich heraus, dass bei Messzellen mit 4 Wochen lang gelagerten Glas-plättchen die wenigsten Probleme auftraten z.B. mit Partikeln unter den Netzchen.

Danach wird ein zwei Millimeter starker O-Ring aufgeklebt. Das so verarbeitete Glasplätt-chen kann zur Reinigung kurz in den Plasmacleaner gegeben werden. Offensichtlich reich-ten die sonstigen Maßnahmen zur Vermeidung von Verunreinigungen (z.B. Arbeireich-ten unter der Flow-Box, verwendete Materialien autoklavieren usw.) aus, da die Reinigung im Plas-macleaner keine weitere Verbesserung herbeiführte. Vielleicht kompensierte der Umstand, dass der Plasmacleaner nicht in der Flow-Box stand und das Präparat somit kurz an der normalen Raumluft war, den Effekt der Reinigung. Deshalb wurde dieser Schritt nur bei den anfangs hergestellten Messzellen durchgeführt und später weggelassen. Die Suspensi-on wird dann in den O-Ring gefüllt und darauf wird ein weiteres Glasplättchen geklebt (Abb. 3.5).

Abb. 3.5: Schematischer Aufbau einer Messzelle

Das TEM-Netzchen ist aus Kupfer und somit für diesen Aufbau geeignet, da Kupfer para-magnetisch ist.

Oft passierte es, dass Kolloidpartikel unter das Netzchen gelangten. Um dieses Problem schnell erkennen zu können, wurde die Messzelle im Experiment auch von unten beleuch-tet. Die Unterseite des Kupfer-Netzchens reflektierte dieses Licht und darunter liegende Kolloid-Partikel konnten sofort gesehen werden. Um das Problem in den Griff zu bekom-men, wurde mit verschieden dicken PMMA-Filbekom-men, einer unterschiedlich langen Auf-drückzeit der Kupfer-Netzchen und einer längeren Lagerzeit im Ofen experimentiert. Beim Spincoating wurden dafür Umdrehungszahlen von 1800 bis 2800 U/min verwendet. Die Aufdrückzeit variierte zwischen 2 und 3 Minuten. Werden allerdings zu dicke Polymerfil-me in der Größenordnung einige µm verwendet, so kann es zu einer Wulstbildung an den Wänden des Netzchens führen, weil es durch das Aufdrücken der Kupfer-Netzchen zu einem Verschieben des PMMA kommt. Dies geschieht aber erst bei wirklich „dicken“

Filmen, da die Unterseite der TEM-Netzchen Kratzer hat (Abb. 3.6), die zunächst einmal viel Volumen des PMMA-Films aufnehmen können.

Die anfängliche Idee, über die Netzchen noch eine dünne PMMA-Schicht aufzubringen, damit keine Partikel unter die Netzchen diffundieren können, erwies sich als nicht ausge-reift, weil sich so in den kreisförmigen Öffnungen ein parabolisches Profil ausbildete, was nicht erwünscht war, da die Wände der Netzchen ja als harte Wände für die Kolloid-Partikel erscheinen sollen.

Die verwendeten TEM-Netzchen haben eine Höhe 15µm und eingeätzte Kreise mit einem Durchmesser von 73µm.

34 Kapitel 3 – Das Experiment

Abb. 3.6: Kratzer in der Unterseite der TEM-Netzchen, Mikroskopbild 100-fache Vergrößerung

Abb. 3.7: Raue Oberseite der TEM-Netzchen, Mikroskopbild 50-fache Vergrößerung

Die Wände der Netzchen sind glatt genug, so dass keine Partikel daran festkleben. Da die Oberfläche aber sehr rau ist (Abb. 3.7), bleiben nach dem Einfüllen der Suspension und dem Absinken der Kolloid-Partikel einige darauf liegen. Deshalb muss die Messzelle vor einer Messung und noch vor dem Einbau in den Probentisch für ungefähr 15 Minuten schräg gestellt werden. So fallen die auf den Netzchen liegenden Partikel in die Kreise und können dann nicht plötzlich während einer Messung nachfallen und die Anzahl verändern.