3 Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurde die Verschaltung von Transkriptionsfaktoren bei der Kontrolle ihrer Zielgene am Beispiel des TEA-Transkriptionsfaktors Tec1 und des Transkriptionsfaktors Ste12 untersucht. Es sollte bestimmt werden, wie Tec1 auf der Ebene der Transkription und der Translation reguliert wird und wie sich diese Regulation auf die Kontrolle von Zielgenen am Beispiel von FLO11 auswirkt.
Im ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Kontrolle der TEC1-Expression unter vegetativen und Konjugationsbedingungen größtenteils durch die PREs erfolgt und die TCS-Elemente nicht benötigt werden. Zudem werden die TEC1-Transkription und die Protein-stabilität durch verschiedene Nährstoffsignale unabhängig von den TCS-Elementen und PREs kontrolliert. Im zweiten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass Mpt5 die Translation von TEC1 vermutlich über den 3‘-UTR kontrolliert. Im letzten Teil der Arbeit wurde die Ste12-vermittelte Kontrolle der TEC1-Expression durch eine synthetische, Doxyzyklin-Ste12-vermittelte Kontrolle ersetzt.
Im Folgenden wird zunächst die Rolle der PRE- und TCS-vermittelten Kontrolle der Expression näher betrachtet und mögliche Mechanismen für die Nährstoffregulation der TEC1-Expression vorgestellt. Anschließend wird die Regulation der TEC1-Translation durch Mpt5 besprochen. Weiterhin wird auf die Regulation der Tec1-Proteinstabilität unter verschiedenen Umweltbedingungen sowie deren Auswirkungen auf das Tec1-Zielgen FLO11 eingegangen.
Abschließend wird diskutiert, wie sich eine synthetische Regulation auf die TEC1-Expression auswirkt und die Verschaltung von Transkriptionsfaktoren innerhalb von Transkriptions-netzwerken näher beleuchtet.
3.1 Die PREs sind für die TEC1-Expression unter vegetativen Bedingungen
nicht beeinflusst (Köhler et al., 2002). Deshalb war ein Ziel dieser Arbeit, die physiologische Relevanz der beiden Regelkreise zu bestimmen, die auf den TEC1-Promotor einwirken.
Es konnte gezeigt werden, dass Tec1 unter vegetativen Bedingungen nicht für die Kontrolle der TEC1-Expression benötigt wird, da die Mutation der TCS-Elemente bei einem guten Nährstoffangebot keinen Effekt auf die Expression von TEC1 hatte. Es fiel allerdings auf, dass die Mutation der TCS-Elemente im TEC1-Promotor die in vitro DNA-Bindung beeinträchtigte, jedoch nicht komplett verhinderte, obwohl bereits gezeigt werden konnte, dass diese Mutation die Bindung von Tec1 an ein FRE verhindert (Madhani and Fink, 1997; Heise et al., 2010).
Möglicherweise befinden sich weitere, niederaffine TCS-Elemente im TEC1-Promotor, die gebunden werden können. Dennoch spielt die Kontrolle der TEC1-Expression durch Tec1 unter vegetativen Bedingungen offensichtlich keine Rolle, da die Expression eines PTEC1-TCS-PRE -CFP*- bzw. eines PTEC1-TCS-PRE-3 × mTurquoise 2*-Reportergens in einem tec1ǻ-Stamm unter vegetativen Bedingungen unverändert war. Genauen Aufschluss darüber ob und unter welchen Bedingungen Tec1 in vivo an seinen Promotor bindet, könnte eine zukünftige ChIP-Analyse geben.
Auch wurde bereits vermutet, dass die basale Expression von TEC1 vermutlich über PREs erfolgt und von Konjugations-spezifischen Komponenten abhängt (Oehlen and Cross, 1998).
Diese Vermutung konnte in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe von Stämmen, in denen die PREs mutiert waren, bestätigt werden. In diesen Stämmen war die Expression von TEC1 stark reduziert und die Deletion von STE12 hatte einen negativen Einfluss auf die Expression eines PTEC1-TCS-PRE-CFP*- bzw. eines PTEC1-TCS-PRE-3 × mTurquoise 2*- Reportergens unter vegetativen Bedingungen. Hier führte die Mutation der PREs im TEC1-Promotor auch zum vollständigen Verlust der in vitro DNA-Bindung durch Ste12. Die Funktion dieser Regulation von Ste12 ist bislang unklar, jedoch könnte es sich hierbei um eine sogenannte „Feedforward“-Schleife handeln, um die Expression von FLO11 zu kontrollieren (vgl. Kapitel 3.6).
Da Tec1 unter vegetativen Bedingungen offensichtlich nicht entscheidend für die Regulation der TEC1-Expression ist, stellt sich die Frage, ob es Bedingungen gibt, unter denen dieser Regelkreis benötigt wird. Um näher zu beleuchten, unter welchen Bedingungen die Regulation über Ste12 oder Tec1 erfolgt, wurde der Einfluss verschiedener Umweltbedingungen auf die TEC1-Transkript- und Tec1-Proteinmengen untersucht. Auch hier zeigte sich, dass unter Konjugationsbedingungen die Regulation der TEC1-Expression nicht über den TCS-vermittelten Regelkreis geschieht, sondern von Ste12 und den PREs abhängig ist. Die Expression von TEC1 war in einem Stamm, in dem die TCS-Elemente des TEC1-Promotors mutiert sind, bei Applikation von Pheromon vergleichbar zu einem Stamm mit einem
unveränderten Promotor. Im Gegensatz dazu war die TEC1-Transkriptmenge in einem Stamm, in dem die PREs des TEC1-Promotors mutiert waren, stark reduziert. Somit konnte nun erstmals direkt gezeigt werden, dass die PREs im TEC1-Promotor eine entscheidende Rolle sowohl für die basale als auch die Pheromon-induzierte TEC1-Transkription spielen. Zudem konnte die Transkriptionsaktivierung des TEC1-Promotors mit Hilfe Fluoreszenz-basierter transkriptioneller Reportergene in vivo untersucht werden. Hier zeigte sich auch ein potentieller negativer Einfluss von Tec1 auf seine eigene Expression, da die gleichzeitige Deletion von TEC1 und die Mutation der TCS-Elemente zu einer erhöhten Transkriptionsaktivierung eines PTEC1-tcs-PRE-CFP*- bzw. eines PTEC1-tcs-PRE-3 × mTurquoise 2*-Reportergens führten. Hierfür spricht auch die Beobachtung, dass die TEC1-Transkript- und Tec1-Proteinmengen sowohl in den haploiden, als auch in den diploiden PTEC1-tcs-pre-TEC1-Stämmen über den Mengen in P TEC1-TCS-pre-TEC1-Stämmen lagen.
Auffällig ist, dass die Konfiguration der PREs im TEC1-Promotor den Voraussetzungen für eine effiziente Transkriptionsaktivierung widerspricht. Somit müssen sich weitere regulatorische Bereiche im TEC1-Promotor befinden, welche eine Transkriptionsaktivierung durch Ste12-Homodimere oder -Heterodimere mit einem weiteren unbekannten Transkriptionsfaktor erlauben. In der Tat zeigt eine Studie, dass Pheromon-induzierte Gene, welche nur ein einzelnes PRE in ihrer Promotorregion haben, oft eine PRE-ähnliche Sequenz besitzen, deren Position und Orientierung relativ zum PRE in einer günstigen Konfiguration sind (Su et al., 2010).
Abb. 32: Orientierung der PREs und PRE-ähnlichen Elemente im TEC1-Promotor.
(A) Schematische Darstellung der Lage der PREs (schwarz) und PRE-ähnlichen Elemente (weiß) im TEC1-Promotor des Laborstamms S288c im Bereich −1 bis −1000. Das mit # gekennzeichneten PRE ist zwischen S288c und Ȉ1278b nicht konserviert. In Ȉ1278b befindet sich an dieser Position ein PRE-ähnliches Element. (B) Gezeigt sind die Sequenzen und Orientierung der PREs und PRE-ähnlichen Elemente im TEC1-Promotor des Laborstamms S288c im Bereich −1 (3‘) bis −1000 (5‘). Die Zahlen geben den Abstand zwischen den Elementen in bp an.
Im TEC1-Promotor des Laborstamms S288c finden sich sechs PRE-ähnliche Sequenzen und im TEC1-Promotor des Laborstamms Ȉ1278b sieben PRE-ähnliche Sequenzen, da PRE II nicht zwischen den beiden Stämmen konserviert ist (Abb. 32). Zwei dieser PRE-ähnlichen Sequenzen liegen in einer günstigen Konfiguration relativ zu den benachbarten PREs vor. Der Abstand zwischen dem PRE an Position −88 bis −94 und dem nächsten stromabwärts gelegenen PRE-ähnlichen Element beträgt 57 bp und sie befinden sich in einer aufeinander zulaufender Orientierung. Der Abstand zwischen dem PRE an Position −503 bis −509 und dem vorletzten stromaufwärts gelegenen PRE-ähnlichen Element beträgt 83 bp und sie liegen in einer repetitiven Konfiguration vor. Ob diese Elemente in vivo durch Ste12 Homodimere gebunden werden, müssen weitere Untersuchungen zeigen.
Die fehlende Konservierung von PRE II zwischen den Laborstämmen S288c und Ȉ1278b könnte evolutionär begründet sein. So sind beispielsweise Unterschiede in der Bindung von Transkriptionsfaktoren an ihre Zielgene zwischen den nahe verwandten Spezies S. cerevisiae Saccharomyces mikatae und Saccharomyces bayanus, oder zwischen verschiedenen S. cerevisiae-Stämmen hauptsächlich in Unterschieden bei den cis-Elementen begründet (Borneman et al., 2007; Zheng et al., 2010). Durch Mutationen können in verschiedenen Stämmen oder verwandten Spezies neue Bindestellen entstehen, oder vorhandene Bindestellen verloren gehen, und ermöglichen so die rasche Anpassung der Genexpression an neue ökologische Nischen (Borneman et al., 2007; Li and Johnson, 2010).