2 Ergebnisse
2.7.1 Präparative Synthese von (S)-Flurbiprofen
Für einen präparativen Ansatz der Flurbiprofensynthese wurde das immobilisierte Enzym aus dem Zelllysat in einem 20 mL Maßstab eingesetzt und das Produkt nach vollständigem Umsatz mittels Extraktion in die organische Phase überführt. Die organische Phase wurde anschließend mit einem Rotationsverdampfer entfernt.
68
Abbildung 50: Schematische Darstellung der AMDase-CLGIPL katalysierten Synthese von (S)-Flurbiprofen mittels immobilisierten Enzym.
Die Umsetzung von 152,2 mg Flurbiprofenmalonsäure wurde mit 12,54 g/L Trägermaterial in einem Rührkesselreaktor durchgeführt und der Verlauf analytisch mittels HPLC verfolgt (Abbildung 51). Nach vollständigem Umsatz nach 22 h Reaktionszeit wurde das Produkt in einer dreistufigen Extraktion mit Ethylacetat in die organische Phase überführt. Nach einer dritten Extraktion konnte von dem Zielprodukt in der wässrigen Phase kein verbleibender Rest mehr detektiert werden.
Abbildung 51: Umsetzung von 152,2 mg Flurbiprofenmalonsäure im präparativen Ansatz zur Produktisolierung.
Reaktionsbedingungen:
V = 20 mL, URührer = 600 rpm, pH 8,5, cTris-Puffer = 10 mM, c FbpMA, Start = 26,35 mM, T = 30, 12,6 g/L Träger mit immobilisierter AMDase-CLGIPL aus dem Zelllysat.
Es konnte ein Produkt mit hoher optischer Reinheit von >99 % ee des (S)-Flurbiprofens mit einer isolierten Ausbeute von 99,1 % erzielt werden.
69
Ein Nachteil der Extraktion stellt jedoch der erhöhte Verbrauch an Lösungsmittel dar. Dies bewirkt einen negativen Einfluss auf die Ökobilanz des Systems. Der Einsatz des Ethylacetats für die Produktaufarbeitung führt in einer Analyse der Ökoeffizienz der enzymatischen Reaktion einen erhöhten Verbrauch an CO2. Demnach sind alternative Produktaufarbeitungen für die Prozessgestaltung geeigneter.
• Die wiederholte Anwendung des Immobilisates in der (S)-Flurbiprofen Synthese konnte erfolgreich demonstriert werden.
• Bei der Synthese im präparativen Maßstab wurde (S)-Flurbibrofen mit einer Ausbeute von 99 % und einer Enantiomerenreinheit von ee >99 % des (S)-Enantiomers erfolgreich hergestellt.
Präparative (S)-Naproxen Synthese mit immobilisiertem Enzym
Die kinetische Charakterisierung der immobilisierten AMDase-CLGIPL an Amino C2 Acrylatträger zeigte einen hohen KM und einen inhibierenden Effekt durch das gebildete Naproxen. Die enzymatische Aktivität ist insbesondere bei niedrigen Substratkonzentrationen und am Ende der Umsetzung bei hohen Produktkonzentrationen herabgesetzt.
Ein Batch-Konzept für die Synthese stellt sich als die beste Wahl heraus, da in kontinuierlich betriebenen Reaktorsystemen der hohe KM und/oder der inhibierende Effekt des Naproxen mit einer überproportionalen hohen Menge an eingesetztem Enzym umgangen werden müsste, um vollen Umsatz zu erreichen.
Als Batch-Reaktoren wurde hierbei zum einen ein normaler herkömmlicher Rührkesselreaktor gewählt und zum anderen ein rotierender Festbettreaktor gewählt (engl.: rotating bed reactor (RBR), SpinChem®). (Abbildung 52). Dieser spezielle Rührkesselreaktor ist mit einem Einsatz am Rührerelement ausgestattet, in welchem das immobilisierte Enzym von der Reaktionslösung separiert eingesetzt werden kann. Dies kann Diffusionslimitierungen reduzieren, die enzymatisch Stabilität auf dem Träger erhöhen und ermöglicht eine einfache Abtrennung und Rezyklierung des Biokatalysators in einer wiederholten Anwendung (Mallin et al. 2013).
70
Abbildung 52: Vorgehen der biokatalytischen (S)-Naproxen-Synthese.
Für die Synthese des Naproxens wurde die Reaktion auf 100 mL hochskaliert. In beiden Rührkessel Systemen STR und RBR - wurde für die Vergleichbarkeit die Reaktion unter identischen Bedingungen durchgeführt (Rührergeschwindigkeit, Temperatur, Biokatalysatormenge). In beiden Reaktorsystemen konnte die vollständige Umsetzung von 48.8 mM Naproxenmalonsäure erreicht werden (Abbildung 53). Die Reaktionsverläufe der biokatalytischen Naproxen-Synthese weisen in dem normalen Rührkesselreaktor und dem rotierenden Festbettreaaktor ähnliche Reaktionsverläufe auf. In beiden Systemen konnte die vollständige Umsetzung in einer fünffachen Anwendung der immobilisierten Enzympräparation eingesetzt werden.
71
Abbildung 53: Wiederholte Batch-Versuche der Naproxenmalonsäure Umsetzung in den beiden Rührkesselreaktorkonzepten STR und RBR. Reaktionsbedingungen: V = 100 mL, URührer = 700 rpm, pH 8 (justiert mit 1 M NaOH), c NM, Start = 48,6 mM, T = 30 °C, 45 g/L AMDase-CLGIPL an Amino C2 Acrylat. Beladung:
8,6 mgAMDase-CLGIPL/gTräger. Zwischen den Experimenten wurde der Träger mit 100 mL Wasser gewaschen und bei 4 °C gelagert oder sofort wieder eingesetzt.
Die experimentellen Daten der Naproxen Synthese in den beiden Reaktor-Setups liegen nah an der theoretischen Umsetzung, die mit Hilfe des kinetischen Modells berechnet werden kann (Abbildung 54). Die realen Umsätze zu Naproxen in dem klassischen Rührkesselreaktor (STR) und im rotierenden Festbettreaktor (RBR) verlaufen etwas schneller als das vorhergesagte Modell.
Abbildung 54: Experimentelle Daten der Naproxen Bildung und Simulation des kinetischen Modells. Kinetische Daten:
vMax = 3,62 U/mg; KM, NM =22,14 mM;
Ki, Nap =26,34 mM.
Reaktionsbedingungen: V = 100 mL, URührer = 700 rpm, pH 8 (justiert mit 1 M NaOH), c NM, Start = 48,6 mM, T = 30 °C, 45 g/L AMDase-CLGIPL an Amino C2 Acrylat. Beladung: 8,6 mgAMDase-CLGIPL/gTräger.
72
Genaueren Analysen der spezifischen Aktivitäten in den beiden Reaktionskonzepten zeigen, dass im rotierenden Festbettreaktor System eine ca. 20 % (0,5 U/mgImmo Enzym) geringere Aktivität in der ersten Anwendung des immobilisierten Enzymes gefunden werden kann (Abbildung 55). Die maximalen Aktivitäten in den erneuten Anwendungen zeigen einen etwas geringeren Aktivitätsverlust über die reale Batch-Zeit in dem rotierenden Festbettreaktor System. Die enzymatischen Halbwertszeiten konnten τ1/2, RBR 23 h und τ1/2, STR 21 h ermittelt werden. Ausgehend von der maximalen Aktivität und der enzymatischen Desaktivierung lässt sich dementsprechend eine TTN von 80,000 für den RBR und 100,000 für den STR ermitteln.
Diese Werte für die TTN sind vergleichbar mit repräsentativen Biokatalysatoren zwischen 104 bis 107 (Rogers & Bommarius 2010). Jedoch gilt hierbei zu bedenken, dass es sich lediglich um eine Annäherung handelt und einfließende Parameter wie die Kinetik vernachlässigt werden.
Abbildung 55: Untersuchung der Stabilität der immobilisierten AMDase-CLGIPL in den beiden wiederholten Batch-Versuchen im STR und im RBR.
Reaktionsbedingungen: V = 100 mL, URührer = 700 rpm, pH 8 (justiert mit 1 M NaOH), c NM, Start = 48,6 mM, T = 30 °C, 45 g/L AMDase-CLGIPL an Amino C2 Acrylat. Beladung:
8,6 mgAMDase-CLGIPL/gTräger. Zwischen den Experimenten wurde der Träger mit 100 mL Wasser gewaschen und bei 4 °C gelagert oder sofort wieder eingesetzt.
Zusammenfassend ist die erreichbare Produktivität in beiden Reaktorsystemen vergleichbar.
Insbesondere bei der Handhabung zur Abtrennung des Biokatalysators für die Wiederverwendung und beim Waschen des Trägermaterials zeigt das System im RBR deutliche apparative Vorteile. Dies spart insbesondere in einem angestrebten Prozess Zeit in der Prozessdurchführung. Allerdings kommt der RBR bei der Maßstabsvergrößerung im Vergleich zum klassischen Rührkessel schnell an seine Grenzen.
73
Tabelle 9: Prozess Parameter der immobilisierten AMDase-CLGIPL-Mutante berechnet aus den experimentellen Daten in der Naproxen-Synthese in STR und RBR.
Parameter STR RBR
τ1/2[h] 21,0 ± 0,3 23,1 ± 1,5
kcat [h-1] 3526,8 ± 53,6 2499,2 ± 158,2
kdes [h-1] 0,033 ± 0,0005 0,03 ± 0,002
TTN [-] 106.873 ± 1625 83.306 ± 5273