Zusammenfassend ist es sehr wahrscheinlich, dass die Stimulation der HCV-Translation durch die leberspezifische microRNA-122 in humanen Zellen aufgrund der Position der Ziel-Sequenzen in direkter Nähe zur IRES im Stadium der Initiation stattfindet. Dabei ist eine Wirkung von Komponenten der miRNP-Komplexe auf verschiedene Schritte der Translationsinitiation denkbar, die entweder durch eine Chaperon-Aktivität oder durch direkte Rekrutierung des zellulären Translationsapparates an die HCV-IRES stimuliert werden könnten. Welcher der möglichen Wirkmechanismen bei der Stimulation der HCV-Translation durch miR-122 in humanen Zellen tatsächlich genutzt wird und welche miR-122-assoziierten Proteine beteiligt sind, soll in weiterführenden Studien eingehender untersucht werden.
Gu et al. (2009) zeigten, dass die Translation einer Reporter-RNA durch Einfügen von Ziel-Sequenzen einer microRNA in der 3´-NTR zu einer Repression der Translation führt, wenn die translatierenden Ribosomen am vorgelagerten Stop-Kodon der Translation dissoziieren (Abb. 57A). Eine Verlagerung des Stop-Kodons nach stromabwärts der Ziel-Sequenzen der microRNA führt dagegen zu einem Verlust der Translationsrepression, da translatierende Ribosomen in dem Fall wahrscheinlich die stabile Anlagerung der Komplexe verhindern (Abb. 57B). Die Interaktion von miRNP-Komplexen mit der 5´-NTR wird möglicherweise in ähnlicher Weise durch den Prozess des
„Scanning“ des 43S-Präinitiatioskomplexes an der 5´-NTR beeinträchtigt (Abb. 57C). Die für microRNAs in tierischen Zellen typische unvollständige Hybridisierung an die Ziel-RNA, die hauptsächlich durch die 5´-„seed“-Region vermittelt wird (Doench & Sharp, 2004; Brennecke et al., 2005; Lewis et al., 2005), ist folglich in abgelesenen Sequenzbereichen einer RNA nicht ausreichend für eine effiziente Anlagerung von miRNP-Komplexen. Dies erklärt, warum wirksame Interaktionen von microRNAs mit der Ziel-RNA wahrscheinlich hauptsächlich an der 3´-NTR stattfinden.
Da es dennoch Berichte über eine Regulation der Translation durch Interaktion mit der 5´-NTR gibt, stellt sich die Frage, unter welchen Bedingungen dies erfolgen kann.
Untersuchungen des Mechanismus der Stimulation der HCV-Translation in humanen Zelllinien in dieser Arbeit zeigten, dass die Interaktion der miR-122 mit der HCV-5´-NTR ebenfalls im Wesentlichen durch Hybridisierung der „seed“-Region vermittelt wird. Die Eigenschaften der Abbildung 57: Translatierende oder „scannende“ Ribosomen stören die Anlagerung von miRNP-Komplexen an die Ziel-RNA. (A), (B) Schematische Darstellung der Resultate aus Gu et al. (2009). (A) Die Interaktion von miRNP-Komplexen mit der 3´-NTR reprimiert die Translation einer gecappten (Cap) und polyadenylierten ((An)) RNA. Die Ribosomen terminieren und dissoziieren am Stop-Kodon des offenen Leserahmens (ORF). (B) Durch Verlagerung des Stop-Kodons nach stromabwärts der Ziel-Sequenz stören translatierende Ribosomen die Anlagerung der miRNP-Komplexe. (C) Die Anlagerung von miRNP-Komplexen an Ziel-Sequenzen in der 5´-NTR wird möglicherweise durch das „Scanning“ der 43S-Präinitiationskomplexe (43S-Komplex) behindert.
Bindung der miR-122 an die HCV-5´-NTR entsprechen also denen, die für die Interaktion von microRNAs mit der 3´-NTR ermittelt wurden (Doench & Sharp, 2004; Brennecke et al., 2005; Lewis et al., 2005). Danach würde man erwarten, dass die Ziel-Sequenzen der microRNA-122 in der 5´-NTR der HCV-RNA nicht funktionell sind.
Interessanterweise konnten Jopling et al. (2008) mit einer Reporter-RNA, die die HCV-IRES enthielt, aber zusätzlich am 5´-Ende gecappt war, übereinstimmend mit der oben beschriebenen Theorie keine stimulierende Wirkung der miR-122 auf die Translationseffizienz der Reporter-RNA feststellen.
Möglicherweise stört hier die Bildung von ribosomalen Komplexen am 5´-Cap-Nukleotid die Interaktion der miR-122 mit den Ziel-Sequenzen in der HCV-5´-NTR und die Anlagerung von miRNP-Komplexen (Abb. 58A).
Das authentische HCV-RNA-Genom enthält jedoch kein Cap-Nukleotid am 5´-Ende (Abb. 58B). Der Vermehrungszyklus des HCV findet ausschließlich im Zytoplasma der Wirtszelle statt, so dass kein Zugang zu den im Kern agierenden Capping-Enzymen besteht. Bisher gibt es, im Gegensatz zu einigen anderen im Zytoplasma replizierenden Viren (Decroly et al., 2008; Li et al., 2008), zudem keinen Nachweis einer Capping-Funktion der viruskodierten Proteine.
Die funktionellen Ziel-Sequenzen der miR-122 sind stromaufwärts der internen Ribosomen-Eintrittsstelle lokalisiert. Dadurch interferiert die Bindung der miR-122 an die HCV-5´-NTR
Abbildung 58: Die Bindung der miR-122 an Ziel-Sequenzen stromaufwärts der HCV-IRES interferiert nicht mit Ablesevorgängen der Ribosomen. (A) Eine nicht authentische 5´-gecappte HCV-RNA wird nicht durch miR-122 stimuliert, da die Bildung von ribosomalen Komplexen am Cap-Nukleotid (Cap) die Anlagerung der miRNP-Komplexe stört. (B) Das authentische HCV-RNA-Genom enthält kein 5´-Cap-Nukleotid. Die Ziel-Sequenzen der miR-122 liegen stromaufwärts der HCV-IRES, wodurch die Anlagerung der miR-122 enthaltenden miRNP-Komplexe nicht mit Ablesevorgängen ribosomaler Komplexe interferiert.
entsprechend der Interaktion von microRNAs mit der 3´-NTR nicht mit den Ablesevorgängen der Ribosomen (Abb. 58B). Übereinstimmend konnte in den Translationsstudien der vorliegenden Arbeit mit nicht gecappter genomischer HCV-RNA und HCV-Reporter-RNA eine Stimulation der Translation durch die miR-122 nachgewiesen werden.
Die Erkenntnisse aus der Untersuchung der Regulation der HCV-Translation durch die miR-122 zeigen, dass die Lokalisation von microRNA-Ziel-Sequenzen stromaufwärts einer internen Ribosomen-Eintrittsstelle eine Möglichkeit der Translationsregulation durch Interaktion von microRNAs mit der 5´-NTR einer RNA bietet, die sonst aufgrund der Bindungseigenschaften der microRNAs hauptsächlich an der 3´-NTR der Ziel-RNA stattfindet. Es besteht daher die Möglichkeit, dass auch die Effizienz der Translation anderer RNAs, die IRES-Elemente enthalten, durch die Interaktion von microRNAs mit der 5´-NTR moduliert wird. Da insbesondere die Translation vieler viraler RNAs durch IRES-Elemente initiiert wird (zusammengefasst in Doudna & Sarnow, 2007), wäre es interessant zu untersuchen, ob diese potentielle Ziel-Sequenzen für wirtsspezifische microRNAs in der 5´-NTR enthalten und deren Translationseffizienz durch diese beeinflusst wird.
Auch Lytle et al. (2007) zeigten, dass die Verlagerung von Ziel-Sequenzen für die microRNA let-7a (miR-let-7a) aus der 3´-NTR einer Reporter-RNA in die 5´-NTR stromaufwärts einer HCV-IRES deren Funktionalität nicht beeinträchtigt. Allerdings wurde anders als bei der Regulation der HCV-Translation durch die miR-122 die Wirkung der miR-let7a durch das zusätzliche Anfügen eines 5´-Cap-Nukleotids nicht vollständig inhibiert. Zudem beschreiben Kloosterman et al. (2004) einen Effekt der microRNA-let7a unabhängig von der Lokalisation der Ziel-Sequenzen in einer gecappten Reporter-RNA. Des Weiteren wiesen Orom et al. (2008) eine funktionelle Interaktion der miR-10a mit der 5´-NTR der für ribosomale Proteine kodierenden mRNA nach, die ebenfalls ein 5´-Cap-Nukleotid enthält. Diese Befunde zeigen, dass es eine weitere Möglichkeit der Translationsregulation durch Interaktion von microRNAs mit der 5´-NTR gibt.
Neuere Publikationen zeigen, dass eine Regulation der Translation in tierischen Zellen auch durch Interaktion von microRNAs mit protein-kodierenden Sequenzen stattfinden kann (zusammengefasst in Rigoutsos, 2009). Die Resultate aktueller Untersuchungen deuten allerdings darauf hin, dass dies eine nahezu vollständige Paarung der microRNA mit der Ziel-mRNA erfordert, was eine Ablösung der miRNP-Komplexe von der mRNA durch translatierende Ribosomen verhindern könnte (Abb. 59) (Duursma et al., 2008; Forman et al., 2008; Tay et al., 2008; Gu et al., 2009).
Übereinstimmend weisen die microRNAs in den oben genannten Studien eine verstärkte Komplementarität zur Sequenz der 5´-NTR der Ziel-RNA auf (Kloosterman et al., 2004, Lytle et al., 2007; Orom et al., 2008). Dies lässt vermuten, dass eine Regulation der Translation auch durch Interaktion von microRNAs mit der 5´-NTR einer gecappten mRNA erfolgen kann, wenn eine verstärkte Basenpaarung der microRNA mit der Ziel-RNA gegeben ist. Es wäre daher möglich, dass unter Berücksichtigung dieser Erkenntnisse weitere funktionelle Ziel-Sequenzen in den 5´-NTRs von mRNAs detektiert werden können, die eine Regulation der Translation durch microRNAs vermitteln.
Die Befunde zeigen insgesamt, dass die Regulation der Translation aufgrund der Bindungseigenschaften der meisten microRNAs in tierischen Zellen hauptsächlich durch Interaktion mit der 3´-NTR der RNAs stattfindet. Die Möglichkeit einer Translationsregulation durch Interaktion mit der 5´-NTR besteht jedoch bei einer Cap-unabhängigen Translation durch Lokalisation der Ziel-Sequenzen stromaufwärts einer IRES sowie bei der Cap-abhängigen Translation durch verstärkte Basenpaarung der microRNA. Die Funktionalität von microRNAs bei der Regulation der Translation wird folglich sowohl von der Position der Ziel-Sequenzen in der RNA als auch von der Bindungskapazität der microRNA an die Ziel-RNA bestimmt. Diese Faktoren könnten des Weiteren einen Einfluss darauf haben, ob eine microRNA reprimierend oder stimulierend auf die Translation einer RNA wirkt.
Nach den oben beschriebenen Kenntnissen erfordert die Regulation der Translation durch Interaktion von microRNAs mit Protein-kodierenden Sequenzen oder der 5´-NTR einer gecappten RNA eine verstärkte Basenpaarung der microRNAs mit der Ziel-RNA. Zum einen wurde gezeigt, dass die vollständige Hybridisierung einer microRNA eine Degradation der Ziel-RNA induziert, wie es auch von siRNAs bekannt ist (Abb. 60) (Hutvanger & Zamore, 2002; Meister & Tuschl, 2004; Yekta et al., 2004). Zum anderen könnte eine stabile Anlagerung von miRNP-Komplexen zu einer Beeinträchtigung der Ablesevorgänge der Ribosomen führen (Abb. 60). Dies lässt vermuten, dass eine wirksame Interaktion von microRNAs mit translatierten Sequenzbereichen und der 5´-NTR gecappter RNAs hauptsächlich in einer Repression der Proteinexpression resultiert. Übereinstimmend mit dieser Hypothese wurde in fast allen bisherigen Studien, die eine Interaktion von microRNAs mit entsprechenden Sequenzen beschreiben, eine reprimierende Wirkung auf die Proteinexpression beobachtet (Kloosterman et al., 2004; Duursma et al., 2008; Forman et al., 2008; Tay et al., 2008).
Abbildung 59: Die Regulation der Translation durch Interaktion von microRNAs mit translatierten Sequenzbereichen erfordert eine verstärkte Basenpaarung der microRNA an die Ziel-RNA. (A) Bei unvollständiger Hybridisierung der microRNA an Ziel-Sequenzen in translatierten Sequenzbereichen (offener Leserahmen, ORF) stören translatierende Ribosomen die Anlagerung der miRNP-Komplexe. (B) Eine verstärkte Basenpaarung der microRNA mit der Ziel-Sequenz führt zu stabiler Anlagerung von miRNP-Komplexen an translatierte Sequenzbereiche der RNA.
Eine Ausnahme beschreibt die Studie von Orom et al. (2008), in der trotz verstärkter Basenpaarung der miR-10a mit der 5´-NTR der für ribosomale Proteine kodierenden mRNA eine Stimulation der Translation nachgewiesen wurde. Dass die Anlagerung von miRNP-Komplexen in diesem Fall nicht zur einer Translationsrepression durch Störung des „Scanning“ der Ribosomen führt, kann möglicherweise dadurch erklärt werden, dass die 5´-NTR der mRNA ribosomaler Proteine nur eine Ziel-Sequenz für die miR-10a enthält (Orom et al. 2008), während an der Repression der Translation durch Interaktion von microRNAs mit translatierten Sequenzen mehrere aufeinander folgende Ziel-Sequenzen beteiligt sind (Kloosterman et al., 2004; Forman et al., 2008; Gu et al., 2009). Die Anlagerung eines einzelnen miRNP-Komplexes an die 5´-NTR stellt möglicherweise kein bedeutendes Hindernis für „scannende“ Translationskomplexe dar, während die Bindung mehrerer miRNP-Komplexe diesen Vorgang beeinträchtigt.
Die Stimulation der Translation der mRNA durch miR-10a wird möglicherweise durch vom Grad der Basenpaarung der microRNA unabhängige Effekte vermittelt. Wie für zahlreiche andere microRNAs gezeigt, hat auch die miR-10a bei Interaktion mit der 3´-NTR einer mRNA einen inhibitorischen Einfluss auf die Translation, während die Bindung an die 5´-NTR von mRNAs ribosomaler Proteine eine translationsfördernde Wirkung hat (Abb. 61B,C) (Orom et al., 2008). Auch die miR-122 reprimiert die Translation durch Bindung an die 3´-NTR einer mRNA (Chang et al., 2004; Henke, Goergen et al., 2008; Jopling et al., 2008) während die HCV-Translation durch Hybridisierung der miR-122 an die 5´-NTR stimuliert wird (Abb. 61A,C). Dies zeigt, dass eine Art microRNA unterschiedliche Wirkungen auf die Translation vermitteln kann. Diese duale Funktion der microRNAs könnte einerseits durch eine Rekrutierung verschiedener Proteine in miRNP-Komplexe hervorgerufen werden, die unterschiedliche Effektor-Funktionen vermitteln. Andererseits könnte auch die Position der Ziel-Sequenzen in der RNA einen Einfluss auf die Wirkung der microRNAs haben.
Bei der HCV-Translation scheint, wie im vorigen Kapitel beschrieben, die Lokalisation der Ziel-Sequenzen in direkter Nähe der HCV-IRES entscheidend für die stimulatorische Wirkung der miR-122 zu sein (Abb. 61A). Für die Stimulation der Translation der mRNA ribosomaler Proteine durch
Abbildung 60: Die verstärkte Basenpaarung von microRNAs mit translatierten Sequenzbereichen der Ziel-RNA reprimiert die Proteinexpression. Eine wirksame Interaktion von microRNAs mit Ziel-Sequenzen in translatierten Sequenzbereichen (offener Leserahmen, ORF) erfordert eine nahezu vollständige Komplementarität der microRNA mit der Ziel-RNA, was zu einer Beeinträchtigung der Ablesevorgänge der Ribosomen oder zu einer Degradation der RNA führen kann.
miR-10a wurde gezeigt, dass diese von einem terminalen Oligopyrimidin-Trakt (5´-TOP-Trakt) abhängig ist, der direkt stromaufwärts der microRNA-Ziel-Sequenz lokalisiert ist (Abb. 61B) (Orom et al., 2008). Der 5´-TOP-Trakt ermöglicht eine Regulation der Translation abhängig vom Wachstums-Status der Zelle (Hamilton et al., 2006; Orom et al., 2008). Unter Wachstumsarrest vermittelt dieser eine Repression der Translation, wobei unter anderem die Anlagerung von inhibitorischen Faktoren vermutet wird (Biberman & Meyuhas, 1999; Hamilton et al., 2006). Eine mögliche Erklärung für den stimulatorischen Effekt der miR-10a wäre daher, dass die Interaktion der microRNA mit der Ziel-RNA in direkter Nähe zum translationsregulierenden 5´-TOP-Trakt die Anlagerung von inhibitorischen Faktoren beeinträchtigt (Orom et al., 2008).
Die Erkenntnisse aus Untersuchungen der Translationsregulation durch miR-122 und miR10a geben folglich Hinweise darauf, dass die Wirkung einer microRNA auch unabhängig von deren Bindungseigenschaften durch die Position der Ziel-Sequenzen bestimmt wird, wobei eine Stimulation der Translation möglicherweise durch Lokalisation der Ziel-Sequenzen in direkter Nähe zu translationsregulatorischen Sequenzen in der 5´-NTR der Ziel-RNA vermittelt wird.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit in Zusammenhang mit anderen Untersuchungen, dass die Funktionalität und die Wirkung von microRNAs bei der Regulation der Translation wesentlich durch die Position der Ziel-Sequenzen der microRNA sowie deren Bindungseigenschaften an die Ziel-RNA bestimmt wird. Diese Erkenntnisse könnten in Zukunft sowohl bei der Auffindung von noch unbekannten funktionellen microRNA-Ziel-Sequenzen sowie bei der Aufklärung des Wirkmechanismus einer microRNA hilfreich sein.
Abbildung 61: Die Position der Ziel-Sequenzen hat einen Einfluss auf die Wirkung von microRNAs auf die Translation. (A) miR-122 stimuliert die HCV-Translation durch Interaktion mit Ziel-Sequenzen (graue Kästen) in der HCV-5´-NTR direkt stromaufwärts der internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES). (B) miR-10a stimuliert die Translation von für ribosomale Proteine kodierende mRNAs durch Interaktion einer Ziel-Sequenz (grauer Kasten) in der 5´-NTR direkt stromabwärts eines terminalen Oligopyrimidin-Traktes (TOP, dunkelgrauer Kasten). (C) miR-122 oder miR-10a reprimieren die Translation einer RNA durch Interaktion mit Ziel-Sequenzen in der 3´-NTR.