Die meisten bisherigen Publikationen beschreiben eine Repression der Translation, die durch Interaktion von microRNAs mit Ziel-Sequenzen in der 3´-NTR von mRNAs vermittelt wird (zusammengefasst in Liu et al., 2008; Chekulaeva & Filipowicz 2009). Dabei werden verschiedene Wirkmechanismen diskutiert. Die meisten Studien deuten auf eine Inhibition der Translationsinitiation hin, indem Proteine des miRNP-Komplexes die Bindung des Cap-Nukleotids durch eIF4F oder die Anlagerung der ribosomalen 60S-Untereinheit blockieren (Humphreys et al., 2005; Chendrimada et Abbildung 52: In Zellen wirkt miR-122 höchstwahrscheinlich in miRNP-Komplexen. Schematische Darstellung der möglichen Interaktion von miR-122 enthaltenden miRNP-Komplexen mit Ziel-Sequenzen (graue Kästen) in der HCV-5´-NTR inklusive der internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES).
al., 2007; Kirakidou et al., 2007; Mahonnet et al., 2007). Andere Studien geben Hinweise auf eine Degradation des wachsenden Polypeptids (Nottrott et al., 2006) oder eine verlangsamte Elongation und frühzeitige Termination der Translation durch Interaktion der miRNP-Komplexe mit der 3´-NTR der mRNA (Petersen et al., 2006). Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Ago-Proteine Deadenylase-Komplexe rekrutieren, was zu Deadenylierung und anschließendem Abbau der mRNAs führt (Rehwinkel et al., 2005; Wu et al., 2006; Eulalio et al., 2009).
Die Resultate dieser Arbeit zeigen, dass die microRNA-122 die Translation der HCV-RNA stimuliert und dass die Stimulation im Gegensatz zur Repression der Translation durch Interaktion der miR-122 mit der 5´-NTR der HCV-RNA vermittelt wird. Übereinstimmend wiesen auch Jopling et al. (2005) eine Interaktion der miR-122 mit der HCV-5´-NTR nach.
Die Ziel-Sequenzen der miR-122 sowie deren Position in der 5´-NTR sind unter den HCV-Genotypen und Subtypen konserviert (Abb. 53A, siehe auch Anhang). Sie liegen in einem einzelsträngigen Sequenzbereich zwischen der Domäne I und II der HCV-5´-NTR stromaufwärts der HCV-IRES, die durch die Domänen II bis IV gebildet wird (Abb. 53B). In keinem HCV-Isolat konnte bisher eine Variation des Abstandes der miR-Ziel-Sequenzen zur Domäne II der HCV-5´-NTR detektiert werden (Abb. 53A,B, gekennzeichnet durch Pfeile), was auf eine funktionelle Relevanz der Abbildung 53: Position der Ziel-Sequenzen der miR-122 in der HCV-5´-NTR. (A) Alignment der ersten 50 Nukleotide verschiedener HCV-Genotypen und Subtypen (Quelle: http://hcv.lanl.gov/content/index). Die Ziel-Sequenzen der miR-122 sind durch graue Kästen markiert. Ein Pfeil kennzeichnet den Beginn der Domäne II der 5´-NTR. (B) HCV-5´-NTR inklusive der internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES). Ziel-Sequenzen der miR-122 sind durch graue Kästen markiert. Die Domänen der HCV-5´-NTR sind durch römische Ziffern (I - IV) gekennzeichnet. (C) HCV-5´-NTR (magenta) gebunden an ein humanes 80S-Ribosom (verändert nach Kieft et al. (2008)). Die ribosomale 60S-Untereinheit ist in blau, die ribosomale 40S-Untereinheit in gelb dargestellt. Die Domänen der HCV-5´-NTR sind durch römische Ziffern (I - III) gekennzeichnet.
Position der Ziel-Sequenzen bei der Stimulation der HCV-Translation hinweist. Abbildung 53C zeigt eine aus cryo-elektronenmikroskopischen Aufnahmen rekonstruierte Darstellung der HCV-5´-NTR gebunden an ein 80S-Ribosom (Kieft et al., 2008). Die miR-122-Ziel-Sequenzen in der HCV-5´-NTR liegen demnach offen an der der Lösung zugewandten Oberfläche der HCV-RNA. Demzufolge besteht die Möglichkeit, dass die an die Ziel-Sequenzen der miR-122 angelagerten miRNP-Komplexe direkt mit der HCV-IRES und den rekrutierten ribosomalen Untereinheiten interagieren. Die Lokalisation der Ziel-Sequenzen der miR-122 in der HCV-5´-NTR in direkter Nähe der HCV-IRES deutet folglich darauf hin, dass die interagierenden miRNP-Komplexe die Translation der HCV-RNA im Stadium der Initiation fördern.
Der erste Schritt der Initiation der HCV-Translation erfolgt im Wesentlichen ohne eine Beteiligung der eukaryotischen Translations-Initiationsfaktoren (eIFs) durch direkte Interaktion der ribosomalen 40S-Untereinheit mit den hochkonservierten Struktur-Elementen in der HCV-5´-NTR (Abb. 54) (Kieft et al., 2001a/b; Otto et al., 2002; Otto & Puglisi 2004). Eine der wichtigsten Vorraussetzungen für eine effiziente Translation der viralen RNA ist dabei eine korrekte Ausbildung der Sekundär- und Tertiärstruktur der HCV-IRES (zusammengefasst in Lukavsky et al., 2009).
Allgemein haben RNA-bindende Proteine durch unspezifische Anlagerung, RNA-Chaperon-Funktion oder RNA-Helikase-Aktivität einen modulierenden Einfluss auf die Struktur der gebundenen RNA, was in den meisten Fällen zu einer Herstellung oder Stabilisierung einer biologisch aktiven Form der RNA führt (zusammengefasst in Rajkowitsch et al., 2007). Eine Struktur stabilisierende und translationsfördernde Wirkung wurde beispielsweise auch für die Bindung des Proteins PTB (Polypyrimidintrakt-bindendes Protein) an die IRES des Maul- und Klauenseuche-Virus (FMDV) gezeigt (Song et al., 2005) und wird für andere IRES-bindende, trans-aktivierende Faktoren (ITAFs) bei der IRES-vermittelten Translation von Picornaviren vermutet (Niepmann, 2009b). Denkbar wäre, dass auch die Bindung von miRNP-Komplexen vermittelt durch die miR-122 an den Sequenzbereich zwischen Domäne I und II der HCV-5´-NTR die Struktur der HCV-IRES stabilisiert. Einen Hinweis darauf geben Analysen der Sekundärstruktur der HCV-5´-NTR mittels des Programmes mfold (Zuker, Abbildung 54: Die Bindung von miRNP-Komplexen könnte die Anlagerung von 43S-Präinitiationskomplexen an der HCV-IRES fördern. Modell der Stimulation der Translationsinitiation durch miR-122. Die HCV-5´-NTR inklusive der internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) und den Ziel-Sequenzen der miR-122 (graue Kästen). Die Domänen HCV-5´-NTR sind durch römische Ziffern (I - IV) gekennzeichnet. Ein Pfeil mit unterbrochener Linie kennzeichnet eine mögliche Interaktion der Nukleotide 21 - 27 mit Sequenzen der Domäne II der HCV-5´-NTR. Die Anlagerung der miRNP-Komplexe und der 43S-Präinitiationskomplexe ist schematisch dargestellt.
2003) (siehe Anhang). Diese zeigen eine mögliche Interaktion der Nukleotide 21 - 27 der HCV-5´-NTR mit Sequenzen der Domäne II in Abwesenheit der miR-122, was zu einer inkorrekten Faltung der Domäne II und III der IRES führt. Liegt der Sequenzbereich zwischen Domäne I und II dagegen wie im Fall einer Bindung von miRNP-Komplexen einzelsträngig vor, bilden sich bevorzugt Haarnadelstrukturen, die den funktionellen Domänen der HCV-IRES entsprechen. miRNP-Komplexe könnten folglich durch eine Wirkung auf die Struktur der HCV-IRES deren Zugänglichkeit für die Interaktion mit 43S-Präinitiationskomplexen erhöhen (Abb. 54) und damit zu einer gesteigerten Effizienz der Bildung von 48S-Komplexen beitragen.
Bei den nächsten Schritten der Translationsinitiation sind des Weiteren Konformationsänderungen erforderlich, die Bildung von translations-kompetenten ribosomalen Komplexen an der HCV-IRES vermitteln. Auch hierbei wäre eine unterstützende Wirkung der Interaktion von miRNP-Komplexen mit den Ziel-Sequenzen der miR-122 vorstellbar.
Die Anlagerung der ribosomalen 60S-Untereinheit an die HCV-IRES geht wie bei der Translationsinitiation an eukaryotischen mRNAs mit der Entlassung der eIFs aus dem 48S-Präinitiationskomplex einher (Unbehaun, 2004; Locker et al., 2007; Lukavsky, 2009). Bei der Initiation der HCV-Translation wird dies durch eine Konformationsänderung in der ribosomalen 40S-Untereinheit induziert (Locker et al., 2007). Diese wird im Wesentlichen durch die Domäne II der HCV-IRES vermittelt, die sich nach der Rekrutierung der 43S-Präinitiationskomplexe L-förmig an die ribosomale 40S-Untereinheit anlagert (Spahn et al., 2001; Locker et al., 2007; Kieft, 2008) (Abb. 55).
Die Lokalisation der Ziel-Sequenzen der miR-122 in der HCV-5´-NTR zeigt, dass die Anlagerung von
Abbildung 55: Die Bindung von miRNP-Komplexen könnte die Anlagerung der ribosomalen 60S-Untereinheit an die HCV-IRES durch Unterstützung einer Konformationsänderung vermittelt durch
Domäne II fördern. (A) Modell der Stimulation der Translationsinitiation durch miR-122. HCV-5´-NTR inklusive der internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) und die Ziel-Sequenzen der miR-122 (graue Kästen).
Die Domänen HCV-5´-NTR sind durch römische Ziffern (I - IV) gekennzeichnet. Die Anlagerung der miRNP-Komplexe und der ribosomalen 40S- und 60S-Untereinheiten ist schematisch dargestellt. (B) HCV-5´-NTR (magenta) gebunden an die ribosomale 40S-Untereinheit (gelb) (verändert nach Boeringer et al. (2005)). Die Domänen der HCV-5´-NTR sind durch römische Ziffern (I - III) gekennzeichnet. Eine mögliche Anlagerung der miRNP-Komplexe und der Einfluss auf die Interaktion der Domäne II mit der ribosomalen 40S-Untereinheit sind schematisch dargestellt.
miRNP-Komplexen einen direkten Einfluss auf die Position der Domäne II in Relation zur ribosomalen 40S-Untereinheit haben könnte (Abb. 55). Es wäre daher möglich, dass die Bindung von miRNP-Komplexen die Konformationsänderung in der ribosomalen 40S-Untereinheit vermittelt durch Domäne II der IRES unterstützt. Dies würde die Anlagerung der ribosomalen 60S-Untereinheit fördern und einen positiven Einfluss auf die Bildung von 80S-Komplexen an der HCV-RNA haben.
Ein weiterer kritischer Schritt für eine effiziente HCV-Translation ist wahrscheinlich die Ablösung der 80S-Komplexe von der Startstelle der Translation an der IRES und der Übergang in die Elongationsphase. Bei der Cap-Nukleotid vermittelten Translation eukaryotischer mRNAs findet die Rekrutierung der ribosomalen Untereinheiten hauptsächlich durch die Interaktion mit eIFs statt, die bei der Bildung der 80S-Komplexe dissoziieren (Jackson et al., 2010, Einleitung, Kapitel 2.1). Die Translationskomplexe liegen danach in einem aktiven Zustand vor, der den direkten Übergang in die Elongationsphase erlaubt. Die Rekrutierung der Ribosomen an die HCV-IRES wird dagegen im Wesentlichen durch direkte Interaktion mit der viralen RNA vermittelt, die mit hoher Affinität an die ribosomale 40S-Untereinheit bindet (Kolupaeva et al., 2000; Kieft et al., 2001b; Otto et al., 2002).
Zudem wird durch die Interaktion der Domäne II mit der ribosomalen 40S-Untereinheit die Exit-Stelle des Ribosoms für die Entlassung der deacetylierten tRNA blockiert (Spahn et al., 2001) (siehe auch Abb. 55B). Die bei der Rekrutierung von Translationskomplexen an die HCV-IRES erforderlichen Interaktionen sind folglich hinderlich für eine effiziente Elongation und müssen zusätzlich zur Dissoziation der eIFs gelöst werden. Wie die Ablösung der HCV-IRES von den ribosomalen Untereinheiten erfolgt ist noch unklar. Es wird vermutet, dass dies durch eine weitere Konformationsänderung induziert wird (Spahn et al., 2001; Boehringer et al., 2005). Auch in dieser späten Phase der Translationsinitiation wäre ein positiver Einfluss von miRNP-Komplexen denkbar, indem deren Anlagerung wie zuvor beschrieben eine Konformationsänderung unterstützt oder die Affinität der HCV-RNA für die Bindung an ribosomale Untereinheiten herabsetzt (Abb. 56). Dies könnte den Übergang zwischen der Initiation und Elongation der Translation beschleunigen, so dass die HCV-IRES schneller für die Interaktion mit neuen ribosomalen Komplexen zur Verfügung steht (Abb. 56).
Abbildung 56: Die Bindung von miRNP-Komplexen könnte den Übergang der Translationsinitiation in die Elongation fördern. Modell der Stimulation der Translationsinitiation durch miR-122. HCV-5´-NTR inklusive der internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) und den Ziel-Sequenzen der miR-122 (graue Kästen).
Die Domänen HCV-5´-NTR sind durch römische Ziffern (I - IV) gekennzeichnet. Die Anlagerung der miRNP-Komplexe und der ribosomalen Untereinheiten ist schematisch dargestellt.
Insgesamt wird deutlich, dass die effiziente Initiation der HCV-Translation durch strukturelle Eigenschaften der HCV-IRES bestimmt wird, die wiederum die strukturellen Eigenschaften der Komponenten des zellulären Translationsapparates für den optimalen Ablauf der Translation modulieren. Es wäre daher denkbar, dass die durch miR-122 rekrutierten miRNP-Komplexe bei der Bildung translations-kompetenter ribosomaler Komplexe an der HCV-IRES als eine Art Chaperon fungieren und so die HCV-Translation stimulieren. Dabei kann spekuliert werden, dass die Anlagerung der miRNP-Komplexe allein, unabhängig von deren Protein-Zusammensetzung, eine fördernde Wirkung hat. Wahrscheinlicher ist jedoch, dass durch die miR-122 bestimmte Proteine an die HCV-5´-NTR rekrutiert werden, die eine Chaperon-Funktion bei der Assemblierung der Translationskomplexe ausüben. Ein möglicher Faktor wäre das Hitzeschock-Protein Hsc70 (Heat shock cognate 70), welches durch UV-Crosslink-Experimente als Bindungspartner der HCV-RNA und der miR-122 identifiziert werden konnte (siehe Henke, Dissertation 2010). Möglich wäre auch eine Beteiligung von anderen RNA-bindenden Proteinen der Familie der heterogenen nukleären Ribonukleo-Proteine (hnRNPs), die sowohl im Zellkern als auch im Zytoplama durch ihre RNA-Chaperon-Aktivität einen Einfluss auf die Prozessierung von RNAs haben (Rajkowitsch et al., 2007).
Für einige dieser Proteine wie das hnRNP L oder hnRNP D wurde sowohl eine Interaktion mit der HCV-5´-NTR als auch eine stimulierende Wirkung auf die HCV-Translation nachgewiesen (Paek et al., 2008; Hwang et al., 2009). Zudem konnten hnRNPs als Bestandteile von miRNP-Komplexen identifiziert werden (Höck et al., 2007).
Neben einer stimulierenden Wirkung auf den Ablauf der Bildung von Translationskomplexen an der HCV-IRES gibt es einen weiteren möglichen Wirkmechanismus der miRNP-Komplexe bei der Stimulation der HCV-Translation. Bei der Translation in humanen Zellen konkurriert die HCV-RNA mit zellulären mRNAs um die Bindung von ribosomalen Untereinheiten. Die Verfügbarkeit von Komponenten des zellulären Translationsapparates an der HCV-IRES könnte daher ein limitierender Faktor für die Effizienz der Translationsinitiation sein. Es wäre möglich, dass Proteine des miRNP-Komplexes direkt an der Rekrutierung von ribosomalen Untereinheiten und eIFs an die HCV-IRES beteiligt sind. Neben einer Funktion bei der Repression der Translation beschrieben Vasudevan &
Steitz (2007), dass Ago2-Proteine unter Zellzyklus-Arrest auch eine Stimulation der Translation eukaryotischer mRNAs vermitteln können. Interessanterweise wurde Ago2 (auch Co-eIF2-A oder eIF2C2 genannt) ursprünglich als Translations-Initiationsfaktor identifiziert (Roy et al., 1988; Zou et al. 1998). Es wurde gezeigt, dass Co-eIF2-A in Anwesenheit von RNA die Bildung des ternären Komplexes fördert und dessen Bindung an die ribosomale 40S-Untereinheit stabilisiert (Roy et al., 1988; Zou et al. 1998). Es wäre daher denkbar, dass durch eine Interaktion der an die Ziel-Sequenzen der miR-122 gebundenen Ago2-Proteine mit dem ternären Komplex eine verstärkte Rekrutierung von 43S-Präinitiationskomplexen an die HCV-IRES stattfindet. Ago2 könnte folglich die Bildung von 48S-Komplexen fördern und damit zu einer Stimulation der Initiation der HCV-Translation beitragen.
Zusammenfassend ist es sehr wahrscheinlich, dass die Stimulation der HCV-Translation durch die leberspezifische microRNA-122 in humanen Zellen aufgrund der Position der Ziel-Sequenzen in direkter Nähe zur IRES im Stadium der Initiation stattfindet. Dabei ist eine Wirkung von Komponenten der miRNP-Komplexe auf verschiedene Schritte der Translationsinitiation denkbar, die entweder durch eine Chaperon-Aktivität oder durch direkte Rekrutierung des zellulären Translationsapparates an die HCV-IRES stimuliert werden könnten. Welcher der möglichen Wirkmechanismen bei der Stimulation der HCV-Translation durch miR-122 in humanen Zellen tatsächlich genutzt wird und welche miR-122-assoziierten Proteine beteiligt sind, soll in weiterführenden Studien eingehender untersucht werden.