zur Polygalakturonsäurelösung hinzugefügt und der enzymatische Abbau im thermokonstanten Brutschrank bei 36° C durchgeführt. Um

Schimmelpilz-bildung^zu

vermeiden,

^wurden einigeKristalle

Thymol zugegeben.

^{Nach 11}

Stunden wurde das braune

Hydrolysat

^mitje ¹⁰gAktivkohle und Celitever¬

setzt, ^zum Sieden erhitztundheiss filtriert. Das farblose Filtrat wurde über 300 cm3 Dowex50 inder H-Formperkoliert^{undam Vakuum}

(12

^mm

Hg,

40 C) ^{auf 250}

cm3

_eingeengt. Zur Ausfällung^dernicht-hydrolysierten Poly¬

saccharideund Enzymeiweisse^wurde das Filtrat mit800 cmJ

95-proz.

Aetha-nol versetzt. Derweisse, flockige Niederschlagwurde abfiltriertund die klare Lösungvorsichtig ^{im Vakuum}

(12

mmHg, ^40°

C)

^zur Trockeneeinge¬

dampft

(17,2

g

Rückstand).

Eine Probedes

glasigen,

amorphenRückstandes ergab papierchromato-graphisch^eine Mischung^von Mono-, Di-, ^{Tri- und} Tetragalakturonsäure, ^ver¬

unreinigt^mitwenigArabinose und Galaktose. Zur

Entfernung

^derArabinose undGalaktose wurde derRückstandin100

cm3

Wassergelöstund mit einer

10-proz. alkoholischen,

^neutralenBleiazetatlösung^{bis zur}

vollständigen

^Aus¬

fällung

der Uronsäurenversetzt. Dervoluminöse

Niederschlag

^wurdeabfil¬

triert, ^{mit 50 cm} 40-proz. ^Alkoholausgewaschen ^undmitAlkohol undAether getrocknet. ^DerweisseNiederschlag ergab

papierchromatographisch

^{ein Ge¬}

mischvon Mono-,

Di-,

^{Tri- und} Tetragalakturonsäure. ^Mono-undTrigalakturon -säurewaren stärker vertreten als Di-und

Tetragalakturonsäure.

AlsBleisalze sinddie Uronsäuren guthaltbar undwerden nicht

vonSchimmelpilzen ^{befallen. Für die} Trennungsversuche^wurdedas Bleisalz-gemisch über Dowex 50

(H-Form)

in die freien Säuren

übergeführt

^und

hie-3

voneine Lösung^{von 5} mg/cm hergestellt.

312. Trennung ^der

Oligogalakturonsäuren

^anAnionenau stauschern

AlsAustauscherharze

(20, 21)

wurden Dowex1, ^{2 und3}

(Hersteller:

^DowChemical International

Ltd., Midland,

Mich.,

U.S.A.)

und Deacidite FF

(Hersteller:

^Permutit

Comp., Ltd., London) gebraucht.

^Alle

vier Austauscher bestehenauseinem mit ca. 10 %

Divinylbenzol

^vernetzten Polystyrolharz. ^{Das Harz vonDowex}

1,

^{2 und 3 ist}

kugelförmig

^{und von} ziemlich einheitlicherKorngrösse

(0,15-0,32 mm).

^{Dowex 1und2 sind stark}

basisch,

^ihreKapazität

beträgt 2,5 mAeq./

g

Trockensubstanz;

^die ionogenen Gruppen^vonbeidenAustauschern sind monofunktionell. Dowex1besitztals

ionogene

Gruppen

Trimethylammoniumgruppen,

^{Dowex 2}

Dimethyl-oxyäthyl-ammoniumgruppen.

^Der Austauscher Dowex 3 ist schwach basischund be¬

stehtaus

freien,

^mono-unddisubstituierten

Aminogruppen.

^Die Kapazität

beträgt 3,5 mAeq./

gTrockensubstanz. Beim Deacidite FF handeltes sich

um einziemlich stark basisches Harzvon

splitterförmiger,

uneinheitlicher Korngrösse

(0,2

^-

0,6 mm).

^DieKapazität

beträgt 1,1 mAeq./

g Trockensub¬

stanz . Dieionogenen Gruppen^{bestehenvorallemaus} Trimethylammonium¬

gruppen.

Vorerst mussten die AnionenaustauschervonVerunreinigun¬

gen und^vonfeinenHarzpartikelchen befreit werden.

DieAustauscherwurden zweimalmit 1-n. NaOH und 1-n.HCl regeneriert. ^Diefeineren

Harzpartikelchen

wurden beim Auswaschen der

überschüssigen

^Säureund Lauge weggeschwemmt. ^{Hieraufwurdeder}rege¬

nerierteAustauscher inder Chloridformauf eine Glasfilternutsche G 4 gebracht^{und mit}Alkohol undAzetonausgewaschen, ^{bisdasFiltratohne}

jeg¬

liche Färbung durchf loss.Anschliessend wurde der Ionenaustauscher noch einmalmit 1-n. NaOH

regeneriert,

mit 1-n. HCl behandeltund erneut mit 1-n. NaOH

regeneriert.

^Der jetztⁱⁿder OH-Form

vorliegende

Austauscher wurde nundurchBehandlung^mit

0,5-n.

^Ameisen-bzw.

Essigsäure

^{teils in}

die Formiat-und teils inAzetatform übergeführt. ^{Um eine}

Hydrolyse

^{zu ver¬}

meiden,^{wurde mit}0,01-n. Ameisensäurebzw. Essigsäure ausgewaschen.

3121. Trennung^{am Dowex}

1,

^{2 und 3}

Die VorversuchezurTrennung ^derOligouronsäuren^wurden mit Dowex

1,

^{2 und 3}

ausgeführt.

^{Die Eluate}wurden mit einemautomatischen Fraktionensammler inFraktionenvonetwa je ¹⁰ cm3 aufgetrennt.

Auftreten,

VerlaufundAbklingender Uronsäurefraktionen wurde kolorimetrischmit

dem Carbazoltest

(41) verfolgt.

Es wurdeaus

jeder

zehnten bis zwanzigsten ^{Fraktion 1cm}3

EluatineinReagensglas pipettiert. Daraufhin wurden in der Kälte

(unter

^dem

Wasserstrahl)

tropfenweise⁶ cm3 konz. HnSO, zugegeben^{unddie Proben} während genau 20 Minuten in einsiedendes wasserbadgestellt. ^Nachherwur¬

den die Proben rasch

abgekühlt

^{und mit}je

0,2 cm3

einer

0,01

-proz. methano¬

lischenCarbazollösungversetzt und gut

durchgemischt.

^{DieUronsäurenrea¬}

gierten^unter

Bildung

^{eines violetten}Farbstoffs. Zu jeder Messung^wurden

Eichlösungen

^von

5, 10, 20, 40,

^{60 und100}/Uronsäuren

/

cm3 mitbestimmt.

Ausserdem wurde

jede

^Fraktion

papierchromatographisch

^auf ihre Einheit¬

lichkeitgeprüft.

Die Vorversuche mit denverschiedenen Anionenaustauschernwur¬

den mitKolonnenvon 10 cm Höhe und1 cmDurchmesser

ausgeführt.

^Die

Durchflussgeschwindigkeit

betrug^{1 cm}3

/

Min. Die Kolonnenwurden tropfen-weise mit 5 cm3 einer Mischung

(25 mg)

^vonMono-,Di-, ^{Tri- und} Tetra-galakturonsäurebeladen. Hierauf wurde mit Ameisen-bzw. Essigsäure ^stei¬

gender

Konzentration

(0,1

^bis

1,5-n.)

perkoliert.

Eswurden Versuche mit Dowex1, ^{2 und3 in} Formiatformund Dowex 1 inAzetatform, ^{mit den} entsprechenden^Säurenals

Elutionsmittel,

ausgeführt.

Bei Perkolation mit0,1-n. Säure erschien die Monogalakturon-säure beim Dowex1inAzetatform schoninder

88.,

ⁱⁿFormiatform

dagegen

erst in der 110. Fraktion. ^Eswurde weiter eluiert bis zur 320. Fraktion, ohnedass einesder Oligomeren^{erschien. Erst nach}zusätzlicherPerkolation von

5,4

^Litern1-n. Ameisensäureerschiendie Digalakturonsäure. ^{Beim Dowex} 2 in der Formiatform erschien die Monogalakturonsäure ^inder112. Fraktion.

Interessantist, ^{dass die} Essigsäure gegenüber Dowex 1 einehöhere Affinität alsdie Ameisen-undMonogalakturonsäure zeigt,während bei den

Gleichge¬

wichtsuntersuchungen^{am ähnlichen Deacidite FF die}Ameisensäure stärker haftet als die Monogalakturon-^und Essigsäure. ^Esmuss

allerdings

^bemerkt

werden,

^{dass die} Trennversucheam Dowex 1 kaumimGleichgewicht erfolg¬

ten.

Beieinem zweiten Versuch wurdendie Dowex-1-Kolonnen in Formiat- undAzetatform nach

Abtrennung

^der

Monogalakturonsäure

aus-gestossenund in 5 Teile

aufgeteilt.

Die einzelnenAustauscherschichten wurden in einer G 4 Nutschemit 4-n. Ameisensäureausgewaschen. ^{Nur das} Filtrat des obersten Fünftels der Kolonne ergab ^{einen starken}

positiven

Im Dokument Trennung von Oligogalakturonsäuren an Anionenaustauschern (Seite 43-46)