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IV. Charakterisierung von Pflanzenmetaboliten

1. Metaboliten aus Centranthus longiflorus ssp. longiflorus (Valerianaceae)

1.2. Pflanzenmaterial und Isolierung

In Zusammenarbeit mit L. Ö. Demirezere wurden aus den Wurzeln von Centranthus longiflorus ssp. longiflorus Substanzen isoliert und im Rahmen dieser Doktorarbeit in ihrer Struktur aufgeklärt. Das Pflanzenmaterial wurde im Juli 2000 in Ostanatolien (Erzurum) in 1960 m Höhe gesammelt und von Y. Kaya203 identifiziert. Ein Musterexemplar (HUEF 96022) wurde im Herbarium der Hacettepe Universität204 hinterlegt.

Die getrockneten und gepulverten Wurzeln (350 g) wurden zweimal mit jeweils 3.5 L Methanol bei 40 – 60 °C extrahiert und der Methanolextrakt im Vakuum eingeengt. Der Rückstand (80 g) wurde in Wasser aufgelöst und mit Chloroform extrahiert. Die Wasserphase wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand (47 g) auf eine Sephadex® LH-20 Säule (MeOH) gegeben. Fraktionen, die Iridoide enthielten, wurden an einer Kieselgelsäule (CHCl3/MeOH 9:1→1:1) chromatographiert. Durch weitere Chromatographie an Kieselgel, Sephadex® LH-20 und RP-18 konnten sieben Substanzen erhalten werden. 4’-Desoxy-kanokosid A (123, 48 mg) und 4’-Desoxy4’-Desoxy-kanokosid C (124, 15 mg) wurden bisher in der

e Frau Prof. Dr. L. Ö. Demirezer und Frau Dr. A. Kuruüzüm-Uz (Hacettepe Universität, Ankara, Türkei) danke ich für die Überlassung der Substanzen sowie für die gute Zusammenarbeit.

Literatur nicht beschrieben, des Weiteren konnten Coniferin (117, 27 mg), Isoconiferinosid (118, 35 mg), Kanokosid A (120, 169 mg), Kanokosid C (121, 70 mg) und Valerosidatum (122, 38 mg) isoliert werden.

1.3. Strukturaufklärung

1.3.1. Bekannte Phenylpropanoide (117, 118) Coniferin (117)

Die Substanz 117 färbt in der Wärme mit Vanillin/H2SO4 lila an und zeigt im ESI-Massen-spektrum ein Ion bei m/z = 365 [M+Na]+ sowie im 13C-NMR-Spektrum 16 C-Atome. Durch das 1H-NMR-Spektrum konnte ein 1,2,4-trisubstituierter Aromat als Strukturelement identi-fiziert werden. Bei einer Suche in Chapman & Hall205 mit der Molmasse, dem Struktur-element des Aromaten und der Anzahl der C-Atome als Suchparameter blieben fünf Möglich-keiten übrig. Durch den Vergleich mit Literaturdaten206 konnte 117 als Coniferin identifiziert werden.

Isoconiferinosid (118)

Die in der Wärme mit Vanillin/H2SO4 blau anfärbende Substanz 118 zeigt im ESI-Massen-spektrum ein Ion bei m/z = 527 [M+Na]+ und die 1H- und 13C-NMR-Daten zeigen Ähnlich-keiten zu 117, wobei die Massendifferenz (∆m/z = 162) und die 13C-NMR-Daten auf einen zusätzlichen Zucker schließen lassen. Durch eine Datenbankrecherche in Chapman & Hall205 mit den gleichen Suchparametern wie bei 117 blieben nur noch Isoconiferinosid (118) und Coniferinosid (119) als Möglichkeiten. Durch Vergleich mit Literaturdaten206 konnte 118 als Isoconiferinosid identifiziert werden.

O O OH O H

H O

O

OR CH3

O

117:

118:

119: RR11 = β- = HD-Glucose R2 = H R2 = H

R1 = H R2 = β-D-Glucose

1 3

5

7 9

3' 3' 2 6'

1

R

1.3.2. Bekannte Iridoide (120 – 122)

Aufgrund des Anfärbeverhaltens (braun) der Substanzen 120 – 122 mit Vanillin/H2SO4 in der Wärme wurde vermutet, dass es sich bei den Substanzen um Iridoide handelt. Mit Hilfe der

1H- und 13C-NMR-Daten sowie den Massenspektren konnten in Chapman & Hall205 Daten-bankrecherchen durchgeführt werden, die zur Identifizierung der Metaboliten 120 – 122 führten.

Kanokosid A (120)

Die Substanz 120 zeigt im ESI-Massenspektrum ein Ion bei m/z = 499 [M+Na]+ und im

13C-NMR-Spektrum 21 C-Atome. Mit diesen Angaben und der zusätzlichen Einschränkung auf Iridoide gab es nur einen Treffer in der Datenbank, Kanokosid A (120). Durch Vergleich mit den Literaturdaten207,208 konnte 120 eindeutig als Kanokosid A identifiziert werden.

Kanokosid C (121)

Das ESI-Massenspektrum von 121 zeigt ein Ion bei m/z = 661 [M+Na]+ und das 13 C-NMR-Spektrum 27 C-Atome. Die 1H- und 13C-NMR-Spektren von 120 und 121 sind sehr ähnlich.

Bei 121 treten zusätzliche Signale im Zuckerbereich auf, was durch die Massendifferenz von

∆m/z =162 bestätigt wird. Mit der gleichen Suchstrategie wie bei 120 gab es ebenfalls nur einen Treffer, Kanokosid C (121). Der Vergleich mit Literatudaten207,208 bestätigte dies.

O O

H OH

OR O OH

O H

H O OH O

CH3 CH3 O

O H

120:121: R = β-R = HD-Glucose

1 5 3

7 9

10

11

1''

4''

5''

1' 5'

Valerosidatum (122)

122 zeigt 21 C-Atome im 13C-NMR-Spektrum, ebenso wie 120, aber ein Ion im ESI-Massen-spektrum von m/z = 485 [M+Na]+. Bei der Datenbankrecherche mit den gleichen Such-parametern wie bei 120 und 121 wurden drei Verbindungen gefunden: Patrinosid, 8-epi-Patrinosid und Valerosidatum (122). Aufgrund der Literaturdaten209,210,211,212 konnte letzteres identifiziert werden.

122 weist im Vergleich mit 120 und 121 eine andere Stereochemie an C-8 auf, was für Substanzen, die aus der gleichen Pflanze isoliert werden, sehr ungewöhnlich ist. Daher wurden selektive NOE-Experimente für 1-H, 7-H, 9-H und 10-H3 durchgeführt, um die Stereochemie zu bestätigen. Die Einstrahlungen zeigen Korrelationen von 10-H3 zu 1-H, 7-H und 9-H, von 9-H zu 1-H, 5-H und 10-H3, von 7-H zu 6-H2 und 10-H3 sowie von 1-H zu 9-H und 10-H3. Zusammen mit den Kopplungskonstanten J1,9 = 4.0 Hz und J6,7 = 3.5 Hz, die für die Konformation des Iridoidskeletts wichtig sind, und durch Vergleich mit 13C-NMR-Daten von 2’,3’-Diacetylvalerosidatum213 und 8-epi-Valerosidatum214 konnte die Stereochemie bestätigt werden. Über die Isolierung von 122 zusammen mit Patrinosid und den Kanokosiden A – D aus Valerian-Wurzeln wurde bereits früher berichtet.207

1.3.3. 4’-Desoxykanokosid A (123)

Der mit Vanillin/H2SO4 in der Wärme braun anfärbenden Substanz kann aufgrund des ESI-Massenspektrums (m/z = 483 [M+Na]+) und mit Hilfe der 1H- und 13C-NMR-Spektren die Summenformel C21H32O11 zugeordnet werden. Beim Vergleich der 1H- und 13 C-NMR-Daten mit denen von 120 wurde eine fast vollkommene Übereinstimmung gefunden.

Unterschiede treten bei vier Zuckersignalen an den Positionen 3’, 4’, 5’ und 6’ auf. Die signifikanteste Änderung war das Fehlen einer Methingruppe bei δH = 3.27. An deren Stelle

O O

H OH

O OH

O H

H O O

H O H

C H3

OH

CH3 CH3 O

1 5 3 6

9

10 11

1''

4''

5'' 1' 5'

122

tritt eine diastereomere Methylengruppe bei δH = 1.35 und 1.91 (JA,B = 12.5 Hz), die für ein desoxygeniertes C-Atom im Zucker spricht. Außerdem wird im Vergleich zu 120 eine Massendifferenz von ∆m/z = 16 beobachtet, die diese Annahme unterstützt. Das 13 C-NMR-Spektrum bestätigt diese Vermutung: Die Signale für C-3’ (∆δC = 6), C-4’ (∆δC = 35) und C-5’ (∆δC = 4) sind ins Hochfeld verschoben, C-6’ (∆δC = 3) hingegen ins Tieffeld, was auf die Abwesenheit der Hydroxygruppe an C-4’ hinweist. Ein Vergleich mit den 13C-Werten von 4-Desoxy-β-D-glucose [δC = 97.1 (C-1), 76.9 (C-2), 71.3 (C-3), 35.1 (C-4), 73.2 (C-5), 64.5 (C-6)]215 unterstützt dieses ebenfalls. Zusammen mit den 1H,1H-COSY-, HSQC- und HMBC-Spektren konnte 123 als 4’-Desoxykanokosid A abgeleitet werden. 123 ist bisher nicht

beschrieben worden und ist ein seltenes Beispiel für Naturstoffe mit einem 4-Desoxyzucker.

1.3.4. 4’-Desoxykanokosid C (124)

Das ESI-Massenspektrum (m/z = 645 [M+Na]+) ergibt, zusammen mit den 1H- und

13C-NMR-Spektren, für die mit Vanillin/H2SO4 in der Wärme braun anfärbende Substanz eine Summenformel von C27H42O16. Aufgrund der Verwandtschaft zu 121 (∆m/z = 16, ein Sauerstoffatom weniger) wurden die spektroskopischen Daten mit denen von 121 und 4’-Desoxykanokosid A (123) verglichen. Das 1H-NMR-Spektrum zeigt die erwarteten Protonen für das Iridoidskelett und die Isovalerylgruppe. Die Kopplungskonstanten von J = 8.0 Hz der anomeren Protonen bei δH = 4.34 und 4.37 stimmen mit einer β-Konfiguration beider Zucker überein. Mit den zusätzlich durchgeführten 2D-NMR-Experimenten kann auf eine 4-Desoxygentiobiose als Zuckereinheit geschlossen werden. Aus diesen Daten lässt sich 124 als 4’-Desoxykanokosid C ableiten. Damit gehört 124 wie auch 123 zu den seltenen Naturstoffen mit einem 4-Desoxyzucker und wurde bisher ebenfalls nicht beschrieben. Ein ähnliches Iridoid, Serrulatosid,216 wurde aus Penstemon serrulatus (Scrophulariaceae) isoliert.

O O

O H

H O OH O

CH3 CH3 O

O

H OH

OH

O H

123

1 5 3

7 9

10

11 1'

4' 5'

1''

4''

5''