NAD(P)H-Oxidasen

NAD(P)H-Oxidasen sind Enzyme, die unter Verbrauch von NAD(P)H und molekularem Sauerstoff Superoxid (O₂^•-) gemäß der folgenden Reaktionsgleichung generieren:

NAD(P)H + 2 O₂ → NAD(P)⁺ + H⁺ + 2 O₂

•-Entdeckt wurden diese Enzyme zum ersten Mal in phagozytierenden Zellen des Immunsystems. Dort dient Superoxid als Ausgangsverbindung für die Bildung aggressiver Sauerstoffverbindungen, um körperfremde Organismen wie Pilze oder Bakterien abzu-töten. Später wurden neben dieser phagozytären Form der NAD(P)H-Oxidase weitere Isoformen in vielen Zelltypen gefunden. In den nicht-phagozytären Zellen erfüllt Superoxid die Funktion eines intrazellulären Signaltransduktionsmoleküls und reguliert auf diese Weise eine Vielzahl zellulärer Prozesse.

1.1.1 Aufbau und Aktivierung der phagozytären NAD(P)H-Oxidase

Die komplexe Struktur der phagozytären NAD(P)H-Oxidase besteht aus sechs Unter-einheiten: zwei Untereinheiten sind membranständig, vier sind im Zytosol lokalisiert. Die große katalytische Untereinheit gp91^phox bildet in der Zellmembran einen Komplex mit dem kleineren Protein p22^phox, dem hauptsächlich stabilisierende Funktionen zukommen.

Nach DeLeo et al., 2000, lagert sich dazu eine noch nicht glykosylierte gp91^phox-Vorstufe nach Aufnahme einer Häm-Gruppe an eine p22^phox-Untereinheit an. Diese beiden Proteine werden zusammen auch als Flavocytochrom b558 bezeichnet, welches für sich allein katalytisch weitgehend inaktiv ist (Vignais, 2002). Die Generierung der Superoxidradikale geschieht erst nach Anlagerung der zytosolischen Untereinheiten p40^phox, p47^phox, p67^phox und der kleinen GTPase Rac2. Unter physiologischen Bedingungen wird die Zusammenlagerung durch Kontakt mit Mikroorganismen oder inflammatorische Botenstoffe ausgelöst. Experimentell kann dieser Vorgang aber auch durch die Zugabe von Zymosan A oder dem Phorbolester PMA induziert werden.

Nach Park et al., 1997, besteht der erste Schritt der Enzymaktivierung in einer Membran-Anlagerung von Rac2. Rac-Proteine weisen eine C-terminale hydrophobe Gruppe auf, an die im Ruhezustand ein inhibitorisches Protein angelagert ist (Abo et al., 1991). Der Austausch von GDP durch GTP bewirkt die Freisetzung des Inhibitors und ermöglicht

durch die freiliegenden hydrophoben Geranylgruppen die Interaktion des Rac-Proteins mit den Membranstrukturen (Knaus et al., 1991).

Im zweiten Schritt erfolgt eine mehrfache Phosphorylierung der p47^phox-Untereinheit durch Proteinkinase C (Lopes et al., 1999). Dieser Vorgang bewirkt eine Konformationsänderung der carboxy-terminalen autoinhibitorischen Region des Proteins. Dies ermöglicht ihm sowohl die Bindung an die p22^phox-Untereinheit (Yuzawa et al., 2004) als auch die Interaktion mit dem p67^phox-Protein, welches infolgedessen an die membrangebundenen Untereinheiten dirigiert wird (de Mendez et al., 1997). Durch die Phosphorylierung einer weiteren autoinhibitorischen Region am N-Terminus des p47^phox-Proteins kann das Protein schließlich selbst an die Membran binden (Ago et al., 2003). Zusätzlich wird die Zusammenlagerung des Enzymkomplexes durch die Bindung des Rac2-Proteins an das p67^phox-Protein gefördert (Koga et al., 1999).

Abbildung 1-1 Zusammengelagerter NAD(P)H-Oxidase-Komplex

Die Funktion der Untereinheit p40^phox ist noch nicht eindeutig geklärt. Wie p47^phox und p67^phox verfügt auch p40^phox über so genannte PB1-Domänen (Sumimoto et al., 2007), über die es mit den anderen Proteinen interagieren kann (Moscat et al., 2006). Während einige Arbeitsgruppen eine hemmende Wirkung des Proteins auf die NAD(P)H-Oxidase-Aktivität beschreiben (Sathyamoorthy et al., 1997, Vergnaud et al., 2000), konnten andere einen aktivierenden Effekt beobachten (Kuribayashi et al., 2002, Tsunawaki et al., 1996). Die Arbeit von Ueyama et al., 2007, liefert eine mögliche Erklärung für die beobachteten Effekte. Demnach wird die p67^phox-Untereinheit durch p47^phox zur Zellmembran und durch p40^phox zu endosomalen Kompartimenten geleitet.

Ein weiterer Aktivierungsschritt liegt in der Modifikation von Lipiden, an welche p40^phox und p47^phox über ihre so genannten PX-Domänen binden können. Dies geschieht sowohl durch die Phosphatidylinositol 3-Kinase als auch durch die Phospholipase C (Kanai et al., 2001, Zhan et al., 2002).

Eine Hypothese besagt, dass Flavocytochrom b558 in drei verschiedenen Konformationen vorliegen kann. Dabei geht man davon aus, dass der Komplex unter normalen Bedingungen inaktiv ist. Durch die beschriebenen Aktivierungsvorgänge wechselt die Konformation dann über eine Zwischenstufe in die aktive Form (Cross et al., 1999). Dieser Vorgang wird höchstwahrscheinlich durch die Bindung von gp67^phox und Rac2 induziert.

Der genaue Mechanismus der Aktivierung konnte bislang nicht eindeutig geklärt werden.

Es ist jedoch davon auszugehen, dass es unter Beteiligung von p67^phox zu einer Übertragung von zwei Elektronen des NAD(P)H auf eine gp91^phox-gebundene FAD-Gruppe kommt (Nisimoto et al., 1999). Anschließend erfolgt der weitere Transfer der Elektronen innerhalb der großen Untereinheit vom reduzierten FAD über zwei Häm-Gruppen auf molekularen Sauerstoff, der dadurch zu Superoxid reduziert wird.

Die gebildeten Superoxid-Radikale werden sowohl extrazellulär als auch in spezifische Granula innerhalb der phagozytierenden Zellen sezerniert. Genmutationen in Untereinheiten der phagozytären NAD(P)H-Oxidase verursachen die Entstehung einer schweren Immundefizienz, die als chronische Granulomatose bezeichnet wird. Die Patienten leiden dabei unter schweren Infektionen, da Mikroorganismen durch den Funktionsverlust des Enzyms nicht mehr abgetötet werden können (Heyworth et al., 2003).

1.1.2 Isoformen der NAD(P)H-Oxidase

In den vergangenen zehn Jahren konnten mehrere Isoformen der phagozytären NAD(P)H-Oxidase identifiziert werden. Im Zuge dessen wird die gp91^phox auch als Nox2 bezeichnet.

Die Isoformen Nox1-5 unterscheiden sich im Wesentlichen durch ihre große katalytische Untereinheit, nach der sie auch benannt sind. Andererseits unterliegen diese Enzyme aber auch unterschiedlichen Aktivierungsmechanismen. Während Nox1 und Nox3 ähnlich wie Nox2 auf spezifische zytosolische Untereinheiten angewiesen sind, konnten für Nox4 bislang keine regulatorischen Proteine identifiziert werden. Interessanterweise benötigen jedoch alle vier NAD(P)H-Oxidasen die membranständige p22^phox-Untereinheit. Im Gegensatz dazu funktioniert die Nox5 p22^phox-unabhängig und wird über eine N-terminale Calcium-bindende Domäne reguliert. In den so genannten DUOX-Enzymen 1 und 2 wird die Nox5 am aminoterminalen Ende zusätzlich durch eine transmembranäre α-Helix erweitert, an deren Ende sich extrazellulär eine Peroxidase-Domäne anschließt (daher duale Oxidase, DUOX, genannt). Auf diese Weise kann das produzierte Superoxid durch die räumliche Nähe einer Peroxidase-Domäne sofort weiter metabolisiert werden.

Abgesehen von den verschiedenen Aktivierungsmechanismen unterscheiden sich die Nox-Isoformen auch in ihrer Aktivität und Lokalisation. Während die Aktivität der Nox1-3 durch weitere assoziierte Proteine reguliert wird, produziert die Nox4 ständig Superoxid, wenn auch in wesentlich geringeren Mengen. Es wird daher vermutet, dass sie maßgeblich an der Regulation des zellulären ROS-Haushalts beteiligt ist und auf diese Weise die physiologischen Prozesse in der Zelle steuert. Gleiches gilt aber im Prinzip auch für die anderen Nox-Isoformen. Während in manchen Zellen nur eine NAD(P)H-Oxidase vorkommt, liegen in anderen Zelltypen unterschiedliche Isoformen nebeneinander vor.