Nachweise der RNase L-Aktivität

2.2.24.1Synthese und Aufreinigung von 2',5'-Oligoadenylaten (MINKS ET AL., 1979b, modifiziert)

Um 2’,5’-Oligoadenylate als Aktivator für die RNase L zu erhalten, wurden diese in Extrakten von HeLa-Zellen synthetisiert und anschließend über Säulenchromatographie aufgereinigt. Hierfür wurde in subkonfluent gewachsenen HeLa-Zellkulturen die Expression der 2’,5’-Oligoadenylatsynthetase durch Induktion mit Interferon-ß erhöht. In Extrakten dieser Zellen wurde die OAS durch synthetische dsRNA aktiviert, um aus ATP 2',5'-verknüpfte Oligoadenylate zu synthetisieren. MINKS ET AL. (1979b) beschreiben, dass mit dieser Methode unter den gewählten Bedingungen innerhalb von 2 h millimolare Mengen von 2',5'-Oligoadenylaten entstehen, wobei das Produkt ein Gemisch verschiedener Kettenlängen mit unterschiedlichem Phosphorylierungsstatus darstellt. Das molare Verhältnis von Trimeren, Tetra-, Penta- und Hexameren wird mit 25:13:4:1 beschrieben. Die Halbwertszeit von 2-5A in HeLa-Zellextrakten ist mit 2 min (30 °C) sehr kurz, die Oligoadenylate können allerdings, wie hier geschehen, durch hohe ATP-Konzentrationen und Fructose-1,6-Diphosphat deutlich stabilisiert werden (MINKS ET AL., 1979c). Auf die Synthese folgte eine säulenchromatographische Aufreinigung der 2-5A mit dem schwachen Anionenaustauscher DEAE, bei der ATP und schwächer geladene Nukleotide entfernt wurden.

Subkonfluent gewachsene HeLa-Zellen wurden für 17 h mit 200 IE/ml IFN-ß in Erhaltungsmedium inkubiert. Die Zellen wurden mit Trypsin abgelöst und dreimal mit PBS gewaschen. 1 Volumen Zellen wurde in 2 Volumen OAS-Lysepuffer resuspendiert und 10 min auf Eis inkubiert. Mit einem Dounce Homogenisator wurden die Zellen auf Eis lysiert und die Zelltrümmer für 10 min bei 14 000 x g und 4 °C abzentrifugiert. Der Überstand wurde bei –80 °C eingefroren und gelagert.

5 μl dieses Zellextraktes wurden mit 20 μl OA-Synthesepuffer versetzt und somit mit 120 mM Kaliumacetat, 25 mM Magnesiumacetat, 20 mM HEPES (pH 7,4), 4 mM Fructose-1,6-Diphosphat, 1 mM DTT, 5 mM ATP und 10 μg/ml poly(IC) im Gesamtansatz für 2 h bei 30 °C inkubiert. Als Kontrolle wurde ein Ansatz mitgeführt, bei dem kein poly(IC) zugesetzt wurde und somit eine zusätzliche Aktivierung der OAS ausblieb. Die Synthese wurde durch 3minütige Inkubation bei 95 °C gestoppt.

Für die Aufreinigung der 2-5A-Syntheseprodukte wurde die DEAE-Cellulose nach Hersteller-angaben vorbereitet, äquilibriert und mit 7 mm Schichthöhe in Glassäulen mit 5 mm Durchmesser gepackt. Die Syntheseansätze wurden mit Waschpuffer auf ein Volumen von 1 ml aufgefüllt und für 2 min bei 1 000 x g zentrifugiert. Die Überstände wurden je zweimal über eine DEAE-Cellulose-Säule gegeben, die daraufhin mit 25 ml Waschpuffer (90 mM KCl in HEPES; pH 7,4) gespült wurde. Die Elution der 2-5A erfolgte mit 2 ml Elutionspuffer (350 mM KCl in HEPES; pH 7,4). Der Kontrollansatz wurde über eine separate Säule aufgereinigt. Das 2-5A-Eluat und das Kontroll-Eluat wurden aliquotiert und bei -80 °C gelagert.

2.2.24.2rRNA-Abbau-Assay zur Bestimmung der RNase L-Aktivität (PLAYER ET AL., 1998, modifiziert)

Mit Hilfe dieses Tests soll die Aktivierbarkeit der RNase L in einem bestimmten Zellextrakt untersucht werden. Die Lysate der zu untersuchenden Zellen dienen als Quelle für die RNase L sowie ihr Substrat. Hemmende und aktivierende Faktoren, wie der RNase L-Inhibitor und 2-5A, werden ebenfalls aus den Zell-Lysaten in den Test mit eingebracht. Es folgt eine Inkubation der Proben, mit oder ohne exogene RNase L-Aktivatoren, und eine Aufbereitung der als Substrat dienenden rRNA bis zu ihrer Visualisierung im Agarosegel.

Vergleiche der Abbaumuster induzierter und nicht induzierter Ansätze erlauben Aussagen über die Aktivierbarkeit der RNase L in dem jeweiligen System. Als RNase L-Aktivator wurde das 2-5A-Produkt der unter 2.2.16 beschriebenen Synthese verwendet.

Für den rRNA-Abbau-Assay wurden in der Regel konfluent gewachsene Zellkulturen verwendet. Die zu untersuchenden Zellen wurden mit Trypsin abgelöst und mit PBS gewaschen. Das Zellpellet wurde auf Eis mit dem 1,5fachen Volumen an NP-40-Lysepuffer durch moderates Pipettieren vermischt und für 5 min inkubiert. Es folgten zwei Zentrifugationsschritte, bei denen der Überstand jeweils für 10 min bei 10 000 x g und 4 °C geklärt und in ein neues Reaktionsgefäß überführt wurde. Schließlich wurde die Probe aliquotiert, schockgefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert. Ein Aliquot wurde jeweils für eine Proteinbestimmung nach Bradford eingesetzt.

Pro Ansatz wurden 200 μg Protein eingesetzt, die in einem Gesamtvolumen von 20 μl mit 10 mM HEPES (pH 7,5), 100 mM KCl, 5 mM Magnesiumacetat, 1 mM ATP und 14 mM 2-Mercaptoethanol, sowie einer Verdünnung des RNase L-Aktivators bei 30 °C für 15 bis 120 min inkubiert wurden. Als Aktivator wurde das 2-5A-Eluat in Endverdünnungen von 1:10 bis 1:1 000 verwendet, um die RNase L maximal zu aktivieren. Nach der Zugabe wurde die Inkubationszeit sofort gestartet. Als Kontrollen wurden Ansätze mit dem Kontroll-Eluat (s. 2.2.16) mitgeführt.

Direkt nach Ablauf der Inkubation wurden die Ansätze auf Eis gestellt und die RNA extrahiert. Hierbei wurde das Volumen der Proben nach Guanidiniumthiocyanat-Zugabe mit H₂O um 180 μl erhöht. Bei diesem Schritt wurde ggf. auch der R260-Standard zugegeben (s.

2.2.13.1), um eine konstante Bezugsgröße in der Proben-RNA zu erhalten, deren Komponenten komplett durch den Abbau beeinflusst wurden. Nach der Extraktion wurde die RNA photometrisch quantifiziert und schließlich in einem 1,6%igen Agarosegel aufgetrennt und dokumentiert, wobei nicht über 2,5 μg RNA eingesetzt wurden um Sättigungs-phänomenen bei der Darstellung vorzubeugen (2.2.10.1, 2.2.10.2).

2.2.24.3RNase L-Aktivitäts-Assay mit ³²P-markiertem Substrat

Mit diesem Test sollte, im Gegensatz zu dem rRNA-Abbau-Assay (s. 2.2.24.2), eine Aussage über die RNase L-Aktivität in Zell-Lysaten nicht über ein internes, sondern über ein zugesetztes Substrat ermöglicht werden. Hierfür wurde ein ³²P-markiertes, 20 nt langes RNA-Oligonukleotid der Sequenz C₁₁UUC₇ verwendet. Da die RNase L eine Präferenz für Schnitte auf der 3’-Seite von 5’UpNp3’-Motiven aufweist und nicht in der Lage ist, poly(C) zu degradieren, erzeugt ein Abbau dieses Substrates durch rekombinante, gereinigte RNase L die Produkte C₁₁UU und C₇ sowie deutlich geringere Mengen von C₁₁U und UC₇ (CARROLL ETAL., 1996).

Für die Markierung des RNA-Substrates wurde das J-Phosphat von [J³²P]ATP mittels der T4 Polynukleotidkinase an das 5’-Hydroxyende des Oligonukleodides transferiert (forward kinasing reaction). Hierfür wurden 10 pmol des Oligonukleodides mit 20 pmol [J³²P]ATP (6 000 Ci/mmol) und 5 U T4 Polynukleotidkinase in einem Gesamtvolumen von 50 μl 1 x T4 PNK-Reaktionspuffer zusammengegeben. Vor der Zugabe des Enzyms wurde dieses jeweils nach Herstellerangaben mit dem zugehörigen Verdünnungspuffer 1:60 vorverdünnt. Die Kinasereaktion erfolgte während einer 30minütigen Inkubation bei 37 °C, gefolgt von der Termination der Reaktion für 5 min bei 65 °C. Für eine grobe Aufreinigung der Oligo-nukleotide wurde der Reaktionsansatz mit 5 μl 3 M Natriumacetatlösung versetzt und dann nach Zugabe von 165 μl abs. Ethanol für 30 min bei -20 °C zur Fällung inkubiert. Die Verwendung von Ammoniumacetat als Quelle monovalenter Kationen, welches die Copräzipitation der freien Nukleotide reduzieren sollte, brachte hier keinen Vorteil. Nach Zentrifugation für 20 min bei 12 000 x g wurde das Pellet je einmal mit 80%igem und 95%igem Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und schließlich in RNase-freiem Wasser gelöst.

Für die Aktivitätsbestimmung wurden mehrere Verdünnungen des markierten Substrates 1:1 mit der Szintillationsflüssigkeit OptiPhase Supermix versetzt und im Lumineszenz-Counter vermessen. Bis zu 15 % der in die Kinasereaktion eingesetzten Radioaktivität konnten nach der Fällung wieder gefunden werden.

Um eine Größenzuordnung von Abbauprodukten des markierten Substrates zu ermöglichen, wurde ein Aliquot desselben durch alkalische Hydrolyse fragmentiert und so ein Längen-Marker generiert. Hierfür wurde ein Teil des Substrates (mit z.B. 4 x 10⁵ cpm) mit H₂O auf 20 μl aufgefüllt und 1:1 mit 200 mM Natriumcarbonat-Lösung (pH 9,0) versetzt. Es folgte eine Inkubation bei 85 °C für 30 min und ggf. eine Lagerung bei -20 °C.

Die Herstellung der Zell-Lysate erfolgte wie für den rRNA-Abbau-Assay (2.2.24.2) angegeben, auch der Reaktionsansatz erfolgte analog zu diesem. Es wurde jeweils Zell-Lysat mit 200 μg Protein eingesetzt und in einem Endvolumen von 20 μl mit 10 mM Hepes (pH 7,5), 100 mM KCl, 5 mM Magnesiumacetat, 1 mM ATP und 14 mM 2-Mercaptoethanol, dem Zusatz von ³²P-markiertem RNase L-Substrat mit 2 x 10⁵ cpm, sowie des RNase L-Aktivators bei 30 °C inkubiert. Als Aktivator kamen die 2-5A-Eluate bzw. die Kontroll-Eluate (2.2.24.1) in 1:10-Endverdünnungen zum Einsatz, wobei die Inkubation sofort nach deren Zugabe gestartet wurde. Diese Menge an Aktivator stellt einen Überschuss dar, der Einsatz in einer 1:20-Endverdünnung hatte keine verminderte Aktivierung zur Folge.

Alternativ wurde der Ansatz mit Aktivator, aber ohne Substrat vorher für 30 min auf Eis präinkubiert und nach Substratzugabe gestartet. Zu unterschiedlichen Zeiten (z.B.: 0, 10,

30 min) wurden je 5 μl aus den Ansätzen entnommen, zu 5-10 μl denaturierendem Ladepuffer gegeben und bei -20 °C eingefroren. Die Auftrennung der Proben erfolgte elektrophoretisch über ein 25%iges denaturierendes Polyacrylamid-Gel (2.2.10.4). Nach dem Lauf wurde das Gel auf ein Filterpapier transferiert und für 2 h im Geltrockner bei 85 °C getrocknet. Hiernach erfolgte eine Autoradiographie (15 min bis 2 h) zur Darstellung des markierten RNase L-Substrats und seiner Fragmente. Die Zuordnung der Degradationsprodukte konnte mit dem fragmentierten Substrat als Größenmarker erfolgen.