Konstruktion eines RNase L-überexprimierenden Systems auf Basis des potenten Expressionsvektors pI.18

0 1 2 3 4 5

RL1 RL2

RL3 RL4

RL6 RL7

RL8 RL10 FRhK-4/pcDNA3.1/RL-Klon

RNase L-mRNA [Expressionsfaktor] B

A

pcDNA3.1/RL_Dneg-Klon

M ZB H₂O 2 9 2* 9*

murine RNase L

Abb. 33: Überprüfung stabil mit pcDNA3.1/RL und pcDNA3.1/RL_Dneg transfizierter FRhK-4-Klone. A: Die RNase L-mRNA der stabil mit pcDNA3.1/RL transfizierten Zellklone wurde mit der real-time RT-PCR quantifiziert. Die normalisierten Werte der Klone wurden durch den Mittelwert zweier stabil mit dem Leervektor transfizierter Zellklone dividiert und somit relativ zu diesen als Expressionsfaktor dargestellt. Die rote Linie kennzeichnet eine unveränderte Expression. Die Zellklone RL2, RL3 und RL6 weisen eine bis zu 4fache Erhöhung der RNase L-mRNA-Expression auf.

B: Die mRNA der murinen, trunkierten RNase L-Variante konnte über eine RT-PCR, mit für die murine RNase L spezifischen Primern, in zwei Zellklonen nachgewiesen werden. Je 2 μg DNA-freier RNA der stabil mit pcDNA3.1/RL_Dneg transfizierten Zellklone wurden in die RT-PCR eingesetzt. Das Plasmid ZB1 diente als Positivkontrolle (ZB), die mit * gekennzeichneten Ansätze wurden ohne Zugabe der Reversen Transkriptase behandelt. Bei den Klonen Nr. 2 und 9 konnte ein schwaches positives Signal nachgewiesen werden, alle anderen waren negativ (nicht gezeigt) (M: "1kbp"-Marker; H2O:

Wasserkontrolle).

3.4.3 Konstruktion eines RNase L-überexprimierenden Systems auf Basis des potenten

Zusätzlich wurde ein Primer für ein trunkiertes 3'-Ende erstellt, der es erlauben sollte, eine Sequenz zu gewinnen, die für eine, der murinen dominant negativen Form äquivalente, carboxyterminal um 89 AS verkürzte RNase L codiert. Die Primer wurden für die geplanten Klonierungsarbeiten mit 5'-endständigen KpnI- bzw. SalI-Schnittstellen versehen. Allerdings war es weder mit Gesamt-RNA-Präparationen noch mit isolierter poly(A)⁺-RNA (2.2.9.2) möglich, aus FRhK-4-Zellmaterial, mit diesen Primern ein RT-PCR-Produkt zu erhalten.

Daher wurde die in ZC5.1 vorliegende, für die humane RNase L codierende, Sequenz als Template herangezogen.

Nach Abschluss der praktischen Arbeiten wurde die Macaca mulatta-RNase L-cDNA von GOSWAMI UND KULKA aus FRhK-4-Zellen gewonnen und sequenziert (nur GenBank/EMBL-Veröffentlichung, Accession-Nr.: DQ644021). Ein Vergleich mit dieser Sequenz zeigte, dass der in dieser Arbeit erfolglos verwendete Sense-Primer am 3'-Ende zwei Fehlpaarungen zu der Makakensequenz aufwies. Daher war die Amplifikation eines Produktes der reversen Transkription mit den gewählten Primern nicht möglich.

Die PCR-basierte Strategie wurde für die Umklonierung der RNase L aus ZC5.1 beibehalten, weil somit zum einen die neue trunkierte Variante unabhängig von der murinen Sequenz erzeugt werden konnte und zum anderen in einem Parallelansatz, über den Sense-Primer, eine Sequenz eingefügt werden sollte. Da die Konstrukte mit der neuen Kozak-Konsensussequenz keine Vorteile brachten, wird hier nicht weiter auf diese eingegangen. Der für die humane RNase L codierende Bereich aus ZC5.1 wurde in normaler Länge und als trunkierte Variante mittels PCR amplifiziert und über die angefügten KpnI- und SalI-Schnittstellen in den pI.18-Vektor inseriert. Die resultierenden Konstrukte waren pI.18/RL und pI.18/RL.

Um die Konstrukte auf ihre Funktionalität zu überprüfen, wurden FRhK-4-Zellen mit ihnen transfiziert und nachfolgend auf die Expression der RNase L, sowie das Verhalten im Aktivitätsnachweis mit dem rRNA-Abbau-Assay untersucht. Die erfolgreiche Expression der plasmidcodierten humanen RNase L konnte mit der indirekten Immunfluoreszenz (2.2.8.2) dargestellt werden. Das trunkierte RL-Protein konnte ebenso nachgewiesen werden (Abb.

34). Im rRNA-Abbau-Assay wiesen die pI.18/RL-transfizierten Zellen eine stark erhöhte RNase L-Aktivierbarkeit auf (Abb. 35). pI.18/RL stellte einen deutlich potenteren Expressionsvektor dar als pcDNA3.1/RL. Während ein funktionales System für die Überexpression der RNase L hergestellt war, konnte für das pI.18/RL-codierte Protein, wie schon für sein murines Vorbild, keinerlei dominant negativer Effekt gezeigt werden. Es wurde

beschlossen, zu versuchen, die Erniedrigung der RNase L-Aktivität über eine siRNA-vermittelte Runterregulation der RNase L zu realisieren.

pI.18/RL'

pI.18 pI.18/RL

A B C

Abb. 34: Nachweis einer Expression der vektorcodierten RNase L-Varianten nach Transfektion in FRhK-4-Zellen mittels indirekter Immunfluoreszenz. Auf Deckgläschen in 12-Well Mikrotiterplatten kultivierte FRhK-4-Zellen wurden unter Verwendung von jetPEI mit 1,2 μg pI.18, pI18/RL oder pI.18/RL' transfiziert. 24 h später wurden die Zellen fixiert und die RNase L mittels indirekter Immunfluoreszenz dargestellt. Die Bilder wurden bei 400facher Vergrößerung auf-genommen. Während die mit dem Leervektor pI.18 transfizierten Zellen lediglich eine Grund-fluoreszenz zeigen (A), finden sich in dem pI.18/RL-transfizierten Ansatz deutlich grün fluoreszierende Zellen, welche die RNase L überexprimieren (B). Die Transfektion des pI.18/RL führte ebenfalls zu einer nachweisbaren Expression der trunkierten RNase L-Variante (C).

pI.18/RL pI.18 pI.18/RL 28S

18S rRNA

2-5A: - + - + - +

Abb. 35: Aktivierung der RNase L in FRhK-4-Lysaten nach Transfektion von pI.18-basierten RNase L-Expressionsvektoren. FRhK-4-Zellen wurden über die Calciumphosphat-Methode mit dem Leervektor pI.18 bzw. den Expressionsvektoren pI.18/RL oder pI.18/RL transfiziert, wobei je 20 μg Plasmid-DNA pro 10 cm-Schale eingesetzt wurden. 2 Tage nach der Transfektion wurden die Zellen lysiert und ein rRNA-Abbau-Assay durchgeführt. Hierbei wurden die Proben für 15 min bei 30 °C mit einer 2-5A-Präparation als RNase L-Aktivator (+) oder einer entsprechenden Kontrollpräparation (-) inkubiert. Nach der Inkubation wurde die RNA extrahiert und in einem 1,6%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Pfeile zeigen die Degradationsprodukte unterhalb der 28S und 18S rRNA. Die Transfektion von pI.18/RL führte zu einer extremen Verstärkung der induzierbaren Degradationsaktivität, während durch pI.18/RL kein dominant negativer Effekt vermittelt wurde.

Um stabil RNase L überexprimierende Zellen zu etablieren, wurden FRhK-4-Zellen jetPEI-vermittelt mit pI.18/RL transfiziert, wobei eine Cotransfektion mit pSV2neo durchgeführt wurde, um Transfektanten mit G418 selektieren zu können. Aus der G418-resistenten Zellpopulation wurden mehrere Klone gepickt und nach Anzucht mit der real-time RT-PCR auf einen erhöhten RNase L-mRNA-Level untersucht. Mit FRhK-4/pI.18/RL-Klon 6 konnte

ein Zellklon mit fast 20fach erhöhtem Level identifiziert werden (Abb. 36). Dieser wurde weiter kultiviert und schließlich einige Passagen später weiteren Untersuchungen unterzogen.

0 5 10 15 20

F1 F2 F3 RL 2

RL3 RL 4

RL 6

RL 7

RL8 RL 9

RL 10

RL11 RL12 FRhK-4/pI.18-Klon

RNase L-mRNA [Expressionsfaktor]

Abb. 36: Überprüfung stabil mit pI.18/RL transfizierter FRhK-4-Klone mittels real-time RT-PCR.

Die RNase L-mRNA der stabil mit pI.18/RL transfizierten Zellklone wurde mit der real-time RT-PCR quantifiziert. Die normalisierten Werte der Klone wurden durch den Mittelwert zweier stabil mit dem Leervektor pI.18 transfizierter Zellklone dividiert und somit relativ zu diesen als Expressionsfaktor dargestellt. Die rote Linie kennzeichnet eine unveränderte Expression. Die Proben F1-3 stellen Kontroll-FRhK-4-Zellen dar. Mit FRhK-4/pI.18/RL-Klon 6 konnte ein Zellklon mit einem um ca. 20fach erhöhten RNase L-mRNA-Level identifiziert werden.

Ein Nachweis der RNase L-Überexpression im Western Blot war nicht erfolgreich, daher wurde versucht, sie in der indirekten Immunfluoreszenz darzustellen. Da die Beurteilung etwaiger leichter Signalunterschiede zwischen verschiedenen Präparaten schwerfiel, wurden stabil transfizierte Zellen zusammen mit untransfizierten FRhK-4-Zellen auf gemeinsamen Deckgläschen kultiviert und analysiert, wobei die Populationen durch eine Deckgläschen-Wand getrennt wurden. Ein nun besser möglicher Vergleich mit der indirekten Immun-fluoreszenz zeigte keine nachweisbare Steigerung der RNase L-Menge in den stabil mit pI.18/RL transfizierten Zellen (Abb. 37A). Die Kontrolle der RNase L-Aktivierbarkeit in den Zellklonen, über den rRNA-Abbau-Assay, wies ebenfalls keine signifikante Veränderung zu den Kontrollzellen auf (Abb. 37B). Dieses Phänomen, dass sich stabil transfizierte Zellklone mit einem initial erhöhten RNase L-mRNA-Level schaffen ließen, die dann aber zu einem späteren Zeitpunkt, wenn die kultivierte Zellmenge weitere Analysen zuließ, keine Anzeichen einer RNase L-Überexpression mehr aufwiesen, zog sich durch alle Versuche ein stabil RNase L-überexprimierendes System zu schaffen.

Das Kulturwachstum der mit den RNase L-Expressionsvektoren transfizierten Zellen verlief langsamer als bei Zellen, die mit dem Leervektor transfiziert worden waren. Diese Beobachtung, zusammen mit einer erhöhten Apoptoseneigung in der Kultur, findet sich auch in der Literatur (CASTELLI ET AL., 1997; ZHOU ET AL., 1998). CASTELLI ET AL. (1997)

vermuten, dass das verlangsamte Kulturwachstum auf einer erhöhten Todesrate der Zellen beruht und nicht auf einer verlangsamten Proliferation. Ein verstärktes Absterben von Zellen war während der Kultivierung allerdings nicht aufgefallen.

FRhK-4 pI.18/RL-Klon 6

28S

18S rRNA

FRhK-4/

FRhK-4/pI.18/RL-Klon 6

FRhK-4

B A

2-5A: - + - +

Abb. 37: Stabil pI.18/RL-transfizierte FRhK-4-Zellen in der indirekten Immunfluoreszenz und dem rRNA-Abbau-Assay. (A) FRhK-4-Zellen (unten) und FRhK-4/pI.18/RL-Klon 6-Zellen (oben) wurden, von einem senkrechten Deckgläschen getrennt (Linie), auf einem gemeinsamen Deck-gläschen kultiviert, fixiert und mit der indirekten Immunfluoreszenz auf eine nachweisbare RNase L-Überexpression untersucht. In den Klon-6-Zellen kann keine, gegenüber den FRhK-4-Zellen gesteigerte, Signalstärke der grünen FITC-Fluoreszenz des sekundären Antikörpers ausgemacht werden. (B) Mit FRhK-4-Zellen und FRhK-4/pI.18/RL-Klon 6-Zellen wurde ein rRNA-Abbau-Assay durchgeführt. Hierbei wurden die Proben für 15 min bei 30 °C mit einer 2-5A-Präparation als RNase L-Aktivator (+) oder einer entsprechenden Kontrollpräparation (-) inkubiert. Nach der Inkubation wurde die RNA extrahiert und in einem 1,6%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Der Pfeil zeigt die Degradationsprodukte unterhalb der 18S rRNA. Eine, auf eine Erhöhung des RNase L-Levels hinweisende, deutlich erhöhte Aktivierbarkeit ist nicht zu erkennen. Auch verlängerte Inkubationszeiten zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Zellen auf.

3.4.4 Konstruktion eines siRNA-basierten Knock Down-Systems für die Reduktion der