Abbildung 49: Bindemotiv von DLA-88*50101.
Als Ankerpositionen sind Position 2 und Position 9 (C-Terminus) identifiziert worden. An Position 2 kommt vor allem ein Isoleucin, Valin oder Leucin vor. An Position 9 ist überwiegend ein Leucin, Valin oder Isoleucin zu finden. Je häufiger eine Aminosäure an einer Position vorkam, desto größer ist diese in der Abbildung dargestellt. Quelle: (95).
K562 DLA-88*50101 Zellen mit BBM.1 Antikörper
Bei der Präzipitation der K562 DLA-88*50101 Zellen mit dem BBM.1-Antikörper wurden insgesamt 296 Peptide gefunden. Die durchschnittliche Länge der Peptide betrug 9 Aminosäuren (n=161). Es konnten Peptide gefunden werden, die auch bei Barth et. al identifiziert wurden. Zusätzlich konnte ein Bindemotiv ermittelt werden (siehe Abbildung 50), dieses deckt sich ebenfalls mit dem ermittelten Bindemotiv von Barth et al. (siehe Abbildung 49).
Abbildung 50: Bindemotiv von K562 DLA-88*50101 Zellen.
Das Bindemotiv konnte durch die MHC-Präzipitation mit dem BBM.1 Antikörper generiert werden, dieses deckt sich mit den Ergebnissen von Barth et. al. Auch hier sind die Ankeraminosäuren an Position 2 und 9 zu finden.
MDCK II Zellen und 12.C8F6 Antikörper
Bei der Präzipitation der MDCK II Zellen mit dem selbst hergestellten 12.C8F6 Antikörper wurden insgesamt 39 Peptide gefunden. Die durchschnittliche Länge der Peptide betrug 9 Aminosäuren (n=12). Die Tabelle zeigt die gefundenen Peptide mit einer Länge von 9 Aminosäuren (siehe Tabelle 4.3).
Es konnte kein Bindemotiv ermittelt werden, da zu wenig aussagekräftige Peptide gefunden wurden. Jedoch konnte das gleiche Peptid (IIQSIRMGM) identifiziert werden, das auch bei den K562 DLA-88*50101 Zellen mit dem BBM.1 Antikörper, sowie mit dem Antikörper 12.C8F6 und auch bei Barth et. al eluiert werden konnte.
Tabelle 4.3: Eluierte Peptide der MHC-Präzipitation von MDCK II Zellen unter der Verwendung des Antikörpers 12.C8F6
Peptid Länge
DTAAQITQR 9
ASLSTFQQM 9
VFGQSGAGN 9
DTIEIITDR 9
DLDYDFQRD 9
LIVIQNPTE 9
IIQSIRMGM 9
MSFCIPTEY 9
ENSDLKVNM 9
LLKGFELMD 9
ASLSTFQQM 9
Der Antikörper 12.C8F6 war in der Lage DLA-88 in einer Säulenimmunpräzipitation zu binden, wodurch Peptide, die von DLA präsentiert wurden eluiert werden konnten.
5 D
ISKUSSIONDie Immuntherapie ist keine neue Therapie in der Veterinärmedizin, allerdings ist die adaptive T-Zell-Immuntherapie ein neues Forschungsgebiet, bei Menschen und Hunden gleichermaßen (136).
Die Entwicklung therapeutischer, personalisierter Peptidimpfstoffe, gegen Tumorerkrankungen ist ein vielversprechender Ansatz der Immuntherapie (89) (137). Sie stellen außerdem eine Therapie dar, für Tumoren mit bisher relativ wenigen medizinischen Behandlungsmöglichkeiten (138). Der Vorteil ist, dass die Vakzinierung für jeden Patienten individuell angepasst werden kann, um so eine spezifische immunologische Antwort zu induzieren. Die individualisierte Impfung hat jedoch in humanen Studien den Nachteil, dass spätestens in der Phase III von klinischen Studien die Wirksamkeit bewiesen werden muss. Die Zusammensetzung des Impfstoffes wird auf den Tumor des Patienten individuell abgestimmt und zeigt nur bei ihm seine spezifische Wirkung. Es ist deshalb notwendig, eine große Anzahl an Probanden zu untersuchen.
Forschungsergebnisse zu der Wirksamkeit und Verträglichkeit beim Hund, könnten somit auch die Therapiezulassung beim Menschen beschleunigen.
Der Hund eignet sich zur Etablierung des „Tübingen Approach“, auch aufgrund der beschriebenen Homologien zwischen HLA- und DLA-Gen-Sequenzen (139) (140), das menschliche und canine Genom zeigen insgesamt große Übereinstimmungen (141). Diese Ähnlichkeit lässt sich dadurch erklären, dass Mensch und Hund schon sehr lange in einer Gemeinschaft leben. Sie sind denselben Pathogenen ausgesetzt, entwickeln dadurch ähnliche Krankheiten und im gleichen Maße spontan entstehende Tumoren (142).
Außerdem stellt der Hund ein ideales Modell für Tumorerkrankungen dar (70) (143) (144) (145) (146) (147) (148). Der Mammatumor des Hundes, kann zur Untersuchung von menschlichem Brustkrebs genutzt werden, da Homologien dieser beiden Erkrankungen festgestellt wurden (65) (70) (146) (149). Etwa 400 erbliche Erkrankungen sind bei domestizierten Hunden charakterisiert, von denen die meisten auch für den Menschen relevant sind.
Es gibt mehrere hundert isolierte Populationen von Hunden (Rassen) und jede hat im Vergleich zum Menschen eine stark reduzierte genetische Variation. Dies vereinfacht das Krankheitsmapping und die Pharmakogenomik. Hunde altern fünf bis achtfach schneller als Menschen, teilen Umgebungen mit ihren Besitzern, werden in der Regel bis zum hohen Alter als Haustier gehalten und erhalten ein hohes Maß an Gesundheitsversorgung (143).
Natürlich vorkommende Krebsarten bei Haustieren und Menschen teilen viele Merkmale, einschließlich dem histologisches Aussehen, der Tumorgenetik, den molekularen Targets, dem biologisches Verhalten und den Reaktionen auf konventionelle Therapien. Die Erforschung von Krebs bei Hunden, gibt wahrscheinlich eine wertvolle Perspektive, die sich von denjenigen unterscheidet, die durch die Forschung von Humanen- oder Nagetier-Tumoren alleine erzeugt werden kann (150).
Sowohl der Hund, als auch der Mensch profitiert von diesem Ansatz des Modells, da es Hunden den Zugang zu innovativen Krebsbehandlungen bietet und hilft, Behandlungen beim Menschen besser verstehen und verbessern zu können (144).
Wir erhoffen uns den „Tübingen Approach“ auf den Hund übertragen zu können.
Eine erfolgreiche klinische Anwendung dieser Therapieform beim Hund, kann dann wiederum einen Erkenntnisgewinn für die Anwendung beim Menschen bewirken, da Modifikationen der Therapie in der veterinärmedizinischen Anwendung flexibler durchführbar sind.
Der Kenntnisstand über canine MHC-Moleküle ist noch nicht so detailliert erforscht, wie beim Menschen. Es müssen Grundlagen geschaffen werden, mit dem Wissen über deren Peptid-Liganden und spezifisch an DLA bindende Antikörper. Es ist nötig, einen spezifischen Antikörper gegen DLA-88 zu generieren. Mit diesem Antikörper können MHC-Präzipitationen durchgeführt werden, welche die fehlenden Erkenntnisse liefern können. Es ist zwar bekannt, dass der IgG2 Anti-MHC-Klasse-I-Antikörper H58A auch an DLA bindet (151), allerdings ist nicht bekannt, an welches MHC-Klasse-I-Molekül dieser bindet. Um sicherzustellen, dass der Antikörper nicht auch an ein MHC-Klasse-Ib-Molekül bindet, wären weitere Untersuchungen nötig.
Für die MHC-Präzipitation wird außerdem eine sehr große Menge Antikörper benötigt, diese hätte nur durch den Kauf ein H58A-Klon produziert werden können, was aus finanziellen Gründen nicht favorisiert wurde. Dennoch konnte der H58A Antikörper für FACS-Analysen, den Western Blot und die Immunpräzipitation als Positivkontrolle verwendet werden.
Um einen monoklonalen Antikörper gegen DLA-88 herstellen zu können, mussten Mäuse mit dem gewünschten Antigen immunisiert werden. Dafür wurde eine Zelllinie benötigt, die DLA-88*50101 in hohem Maß exprimiert. Um eine spezifische Immunantwort zu erhalten, wurden mauseigene Sp2/0 Zellen mit DLA-88*50101 stabil transfiziert. Damit die Immunreaktion gezielt gegen das gewünschte Antigen gerichtet wird, da die mauseigenen Oberflächenproteine keine Immunreaktion auslösen sollten. Man erhält spezifische Antikörper, aber durch den geringen Anteil an Fremdantigen auf der Zelloberfläche der transfizierten Zellen, kann es erschwert sein eine Immunantwort zu generieren. Es wurde nur die α-Kette des DLA-88*50101 für die Transfektion verwendet. Das für den Komplex benötigte β2M wurde von der Zelle die transfiziert wurde bereit gestellt, weshalb kein Antikörper gegen das β2M von DLA-88*50101 generiert werden konnte. Das β2M des Allels stand nicht zur Verfügung und konnte nicht in die Transfektion der Zellen mit einbezogen werden.
Direkt nach der Nukleofektion wurden die Zellen in einer 6 Well Platte kultiviert.
Davon konnten die Zellen des Wells B2 nicht kultiviert werden, sie wurden zwei Tage nach der Transfektion in einem Selektionsmedium kultiviert. Das Absterben der Zellen lag wahrscheinlich an dem zu früh verwendeten Zellkulturmedium mit G418. Die frisch transfizierten Zellen sollten erst nach vier Tagen mit einem Selektionsmedium kultiviert werden, um ein Wachstum zu erreichen.
Es war von großer Bedeutung, die transfizierten Zellen auf ihr Vorhandensein von DLA zu untersuchen. Nur wenn tatsächlich an der Oberfläche DLA-88*50101 exprimiert wird, kann davon ausgegangen werden, dass dieses als Antigen erkannt wird. Daraufhin wird eine Immunantwort auslöst, welche zur Bildung DLA-spezifischer Antikörper führt. Nur wenn das DLA an der Oberfläche exprimiert wird, kann es von Makrophagen und DCs erkannt werden. Sie nehmen das Fremdmaterial auf, um dieses im lymphatischen Gewebe den B- und T-Zellen präsentieren zu können.
Dieser Kontakt bewirkt anschließend die Differenzierung von naiven B-Zellen zu Antikörper sezernierenden B-Plasmazellen und der Differenzierung von naiven T-Zellen in T-Effektorzellen wie zytotoxischen T-T-Zellen oder den für die Sekundärantwort wichtigen Gedächtniszellen. Die Expression des DLA-88 induziert demnach die erwünschte Immunantwort, bei der Lymphozyten differenziert werden, die gegen DLA gerichtet sind.
Wäre das DLA-88 nicht an der Oberfläche exprimiert, könnte eine Immunantwort gegen andere Oberflächenmoleküle der Zelle erfolgen, woraufhin kein spezifischer monoklonaler Antikörper gegen DLA-88 generiert werden könnte.
Mit Hilfe des Antikörpers H58A konnten die transfizierten Zellen getestet und der Klon mit der besten Expression gefunden werden. Für die Immunisierungen wurde der Klon A6 der Sp2/0 DLA-88*50101 Zellen verwendet.