Nachweis von Bartonella

Die Anzucht ist für den diagnostischen Nachweis weniger gut geeignet, da die Kultur von Bartonella spp. lange Inkubationszeiten erfordert, für Primärisolate sollten Kulturzeiten von bis zu 6 Wochen kalkuliert werden. Des Weiteren ist im Blut teilweise nur eine geringe Anzahl von Erregern zu finden. Auch die intraerythrozytäre Lage der Bakterien erschwert die Kultur. Darüber hinaus erweisen sich Bartonellen als empfindliche und anspruchsvolle Erreger, deren Anzucht besondere Bedingungen erfordert, die im folgenden noch genauer erläutert werden (Slater et al., 1990; Regnery et al., 1992a; Anderson and Neuman, 1997; La Scola et al., 2002).

Prinzipiell gelingt die Isolierung von Bartonellen aus Blut, aber auch aus verschiedenen Geweben wie Leber, Niere, Milz, Knochenmark, Lymphknoten und Haut. Ein verbessertes Anzuchtergebnis erhält man durch das Tieffrieren der erregerhaltigen Probe bei –70°C zur Erythrozytolyse und anschließendem Auftauen (Brenner et al., 1997; La Scola et al., 2002), aber auch durch die Lysis-centrifugation-Methode (Isolator® Wampole, Cranbury, NJ) (Brenner et al., 1997). Das beste Wachstum erreicht man mit frischen, festen bluthaltigen Nährböden. Beschrieben wurde die Verwendung von Trypticase-Soja-Agar, Hirn-Herz-Infus (Regnery et al., 1992a) und Columbia- oder Kochblut-Agar (Welch et al., 1992; Drancourt and Raoult, 1993), jeweils unter Zusatz von 5-10 % Schaf- oder Kaninchenblut. Die Nährböden werden dann bei 35-37°C, feuchter Atmosphäre und 5-10 % CO2 inkubiert. Eine weitere Anzuchtmöglichkeit ist die Flüssigkultur in supplementiertem Schneiders Medium (Riess et al., 2008). Hierbei werden die Bakterien in dem ursprünglich für Zellkulturen von Drosophila melanogaster-Zellen geeigneten Medium unter Zusatz von Saccharose und fetalem Kälberserum angezüchtet.

1.4.3.2 Nachweis mittels PCR

Eine schnelle und spezifische Nachweismethode für B. henselae ist die PCR. Mit Hilfe der PCR kann man Bartonella DNA in Blut- und Gewebeproben nachweisen, z.B. in einem befallenen Lymphknoten oder im papulösen Hautareal, das die Primärläsion bei KKK darstellt. Den ersten PCR-gestützten Nachweis entwickelte

Relman et al. (1990). Es sind bereits unterschiedliche Gene für den PCR Nachweis genutzt worden, allen gemein ist die gute diskriminierende Eigenschaft die sie besitzen, wobei einige der Gene zu hohe Ähnlichkeiten unter den Spezies besitzen, so dass eine klare Spezies-Differenzierung nur schwer möglich ist. Nach einer Studie von La Scola et al. (2003) eignen sich sowohl die RNA polymerase beta subunit als auch das Citrat Synthase Gen am besten zur Spezies Differenzierung (La Scola et al., 2003). Insgesamt ist die PCR, verglichen mit dem kulturellen Nachweis, eine wesentlich sensitivere Methode zum Nachweis von Bartonellen.

Tabelle 2. Gene, die zum Nachweis von Bartonella spp. genutzt werden

Gen Bemerkung Referenz

16S rRNA

nur Genus spezifisch mit Modifikationen

Kombination mit Dot Blot- / Southern-Hybridisierung zur Spezies Differenzierung

kombiniert mit RFLP

(Relman et al., 1990; Goral et al., 1994; Goldenberger

et al., 1996; Bergmans et al., 1996; Avidor et al., 1997; Matar et al., 1999) htrA

heat shock protein Nachweis von B. henselae und B. quintana,

Differenzierung mittels Hybridisierung (Anderson et al., 1994;

Goldenberger et al., 1996) ribC

Riboflavin Synthase nested PCR zur Unterscheidung von vier

Bartonella spp. (Bereswill et al., 1999)

16S23S intergenic

spacer region (ITS) Unterscheidung von sechs Bartonella spp.

(Jensen et al., 2000;

(Morozova et al., 2004; La et al., 2004; Aboudharam

et al., 2005) ftsZ

cell division protein

Spezies Differenzierung mittels

Sequenzierung (Zeaiter et al., 2002b) rpoB

RNA polymerase beta subunit

häufig genutzt, Spezies Differenzierung mit RFLP oder HRM real time PCR

(Renesto et al., 2001;

Morick et al., 2009) gltA

Citrat Synthase häufig genutzt, Spezies Differenzierung mit

RFLP (Norman et al., 1995; La

Scola et al., 2003)

1.4.3.3 Serologischer Nachweis

Antikörper gegen B. henselae können mit dem Immunfluoreszenztest (IFT) oder dem Enzymimmunoassay (ELISA) detektiert werden. Der IFT ist wegen seiner kommerziellen Verfügbarkeit und vergleichsweise einfachen Handhabung bisher am Weitesten verbreitet. Es gelten in der Regel Titer von > 1:64 für IgG als erhöht (Regnery et al., 1992b; Anderson and Neuman, 1997; Foley et al., 1998). Hier wird das B. henselae-Antigen zunächst mit Verozellen kultiviert und dann für den IFT eingesetzt. Die kommerziell verfügbaren Tests sind allerdings für humanes Serum etabliert. Auch die Verwendung von Enzymimmunoassays (EIA, ELISA) und Western-Blot ist beschrieben worden (Drancourt, 1996; Vermeulen et al., 2007;

Eberhardt et al., 2009).

1.4.3.4 Typisierung und genetische Variabilität von B. henselae-Isolaten

Ursachen für genetische Variabilität sind Mutation und Rekombination. Mutationen können z.B. durch Fehler bei der DNA-Replikation entstehen und durch mutagene Einflüsse induziert werden. Die Anwendung molekularbiologischer Typisierungsverfahren bei Bakterien ist insbesondere bei epidemiologischen Fragestellungen sinnvoll. Dabei ist es wichtig, die Verbreitung von Klonen oder eng verwandten Stämmen nachvollziehen zu können. Dazu müssen die eingesetzten Typisierungsverfahren ein hohes Diskriminierungspotential aufweisen (RILEY, 2004).

In der Regel werden deshalb Verfahren eingesetzt, die auf der Darstellung hypervariabler Regionen des Genoms basieren. Genotypische Analysen von B.

henselae Isolaten mit Hilfe von verschiedenen genomischen- oder Locus- spezifischen Typisierungsmethoden haben eine Zahl von genetischen Gruppen ergeben. Diese Untersuchungen wurden nicht nur zu Aufklärung von humanen B. henselae-Infektionen, sondern auch zur breiten Charakterisierung der Sammlung von felinen und humanen Isolaten durchgeführt. Diese Charakterisierungen zeigen eine limitierte Diversität der humanen Isolate (Bergmans et al., 1996; Arvand et al., 2001; Dillon et al., 2002). Verschiedene B. henselae-Gene und genetische Loci sind für die vergleichenden Untersuchungen herangezogen worden. Hierzu zählen die 16S und 23S ribosomale DNA, die 16S-23S intergenic spacer region und Fragmente von Protein-kodierenden Genen, wie gltA, ftsZ und pap31 (Birtles and Raoult, 1996;

Zeaiter et al., 2002a; Zeaiter et al., 2002b). Untersuchungen der 16S rRNA-kodierenden Gensequenz zeigen, dass B. henselae Isolate in zwei Typen unterschieden werden können (Bergmans et al., 1996). In Untersuchungen von Katzen in Freiburg konnten mittels 16S rRNA-Sequenzierung diese zwei verschiedenen Typen nachgewiesen werden, von denen Typ I dem Referenzstamm Houston-1 entsprach, der in Houston/USA von einem HIV-Patienten isoliert werden konnte (Sander et al., 1999). Die Mehrzahl der felinen Isolate jedoch entsprach Typ II.

Des Weiteren sind genomische Fingerprint-Methoden angewendet worden wie Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE), arbitrarily primed (AP)- PCR, enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC)-PCR und infrequent restriction site (IRS)-PCR, die nur unvollständige Korrelation mit den 16S rDNA-Typen aufwiesen, sich aber durchaus als diskriminierend eigneten (Sander et al., 1998; Arvand et al., 2001;

Dillon et al., 2002). Andere Studien bezeichnen die PFGE als eine Methode mit hohem Diskriminierungspotential zur Differenzierung innerhalb einer Spezies (Roux and Raoult, 1995; Sander et al., 1997). Des Weiteren wurde zur genetischen Charakterisierung von B. henselae das Multispacer typing von Li et al. beschrieben (Li et al., 2006). Hier wurde anhand von neun hoch variablen intergenic-spacer Regionen eine Charakterisierung vorgenommen. 126 B. henselae-Isolate konnten in 39 Genotypen eingeteilt werden. Des Weiteren war B. henselae genotypisch signifikant variabler als B. quintana. Eine Erklärung für die hohe genetische Diversität konnte jedoch nicht gegeben werden. Isolate aus Asien zeigten aber eine höhere Diversität als Isolate aus Europa oder Amerika. Monteil et al. 2007 nutzten zur genotypischen Charakterisierung von B. henselae-Isolaten die Multiple locus variable number tandem repeat Analyse. Hier wird eine variable Zahl von Tandemwiederholungen (Minisatelliten) mittels PCR bestimmt und zur Charakterisierung eingesetzt. Mit dieser Methode konnten 44 B. henselae Isolate in 35 Profile unterteilt werden (Monteil et al., 2007). Eine weitere Typisierungsmethode ist das Multilocus sequence typing, das Bakterien auf der Basis von Nukleinsäuresequenz-Unterschieden in Fragmenten von Haushaltsgenen (in der Regel 7 an der Zahl) vergleicht. Der Vorteil dieser Methode liegt darin, dass

Sequenzdaten eindeutig sind und in elektronischer Form zwischen verschiedenen Laboren ausgetauscht werden können. B. henselae-Isolate sind bereits mittels MLST charakterisiert worden. Es konnten 14 verschiedene so genannte Sequenztypen anhand der Sequenzunterschiede in acht verschiedenen Haushaltsgenen identifiziert werden (Iredell et al., 2003; Arvand et al., 2007), wobei eine kontinentale Häufung bestimmter Sequenztypen beobachtet werden konnte. Aber auch eine unterschiedliche Verteilung von Sequenztypen auf Katzen- und Human-Isolate konnte gezeigt werden (Arvand et al. 2007).