mRNA - N ACHWEIS (N ORTHERN -B LOTS )

Zur Verhinderung des RNA-Abbaus durch RNasen wurden bidestilliertes Wasser und alle Lösungen, sofern als möglich, für mehrere Stunden unter Rühren mit 0,1 % (v/v) DMPC (Di-methylpyrocarbonat) behandelt und autoklaviert (30 min bei 120 °C). Für die Herstellung von Lösungen (z.B. Tris, EDTA, SDS), die nicht mit DMPC behandelt werden respektive auto-klaviert werden können, wurden zertifiziert RNase-freie Chemikalien verwendet und in DMPC-behandeltem, bidestilliertem Wasser gelöst. Alle Glasgefäße wurden im Trocken-schrank 10 h bei 200 °C sterilisiert. Alle verwendeten Kunststoffkleinteile (Pipettenspitzen, Reaktionsgefässe) wurden zweifach autoklaviert, alle anderen Kunststoff-Apparaturen (Gel-kammer und Blotting-Apparatur) wurden zur Inaktivierung der RNasen mit RNaseAway (Molecular Bio-Products, San Diego, USA) nach Anleitung behandelt.

2.13.1 Herstellung von Gensonden 2.13.1.1 Verwendete Gene und Plasmide

Folgende Plasmide wurden für die molekularbiologischen Arbeiten verwendet (dankenswer-terweise von Dr. K.-J. Kunert¹ [AECI Biotechnology, Modderfontein, Südafrika], Prof. I.

Jepson² [ZENECA Seeds, Bracknell, UK], Prof. D. Klessig³ [Rutgers University, Piscataway, USA] und Prof. D. Inzé⁴ [Belgien] überlassen):

• pGOR, enthält das gor-Gen (Glutathionreduktase) aus E. coli als 1,3 kb EcoRI/HindIII-Fragment ¹

• pIJ312, enthält die gst29-cDNA (29-kD-Untereinheit der Glutathion S-Transferase) aus Z. mays als 900 bp EcoRI-Fragment ²

• pIJ321, enthält die gst27-cDNA (27-kD-Untereinheit der Glutathion S-Transferase) aus Z. mays als 900 bp EcoRI-Fragment ²

• pIJ321, enthält die gst26-cDNA (26-kD-Untereinheit der Glutathion S-Transferase) aus Z. mays als 800 bp EcoRI-Fragment ²

• pCAT1, enthält die cat1-cDNA (Catalase 1) aus Tabak als 1,8 kb EcoRI-Fragment ³

• pCAT2, enthält die cat2-cDNA (Catalase 2) aus Tabak als 1,8 kb EcoRI-Fragment ³

• pCAT3, enthält die cat3-cDNA (Catalase 3) aus Tabak als 1,071 kb SpeI/KpnI-Fragment ⁴

• pAPX, enthält die apx-cDNA (Ascorbatperoxidase) aus Tabak als 1 kb EcoRI/

XhoI-Fragment ³

• pSOD1, enthält die MnSOD-cDNA (Mangan-Superoxiddismutase) aus Tabak als 1 kb PstI-Fragment ⁴

• pSOD2, enthält die chlFeSOD-cDNA (Eisen- Superoxiddismutase) aus Tabak als 0,98 kb PstI-Fragment ⁴

• pSOD3, enthält die cytCuZn-cDNA (cytosolische Kupfer-Zink-Superoxiddismutase) aus Tabak als ca. 584 bp PstI/SpeI-Fragment ⁴

• pSOD4, enthält die chlCuZnSOD-cDNA (plastidäre Kupfer-Zink-Superoxiddis-mutase ) aus Tabak als 305 bp AccI/HindIII-Fragment ⁴

• pGPX, enthält die GPX-cDNA (Glutathionperoxidase) aus Tabak als 0,82 kb EcoR1-Fragment ⁴

2.13.1.2 Transformation von E. coli durch Elektroporation

Für die Amplifizierung der DNA zur Herstellung von Gensonden und für die Tranformation des Tabak mussten die entsprechenden Plasmide in kompetente E. coli eingebracht werden.

E. coli DH5α wurden nach der Methode von Tung (Boehringer, Technical tips online) elektro-kompetent gemacht. Hierzu wurde 1 l Kultur (angeimpft mit 1 ml Ausgangskultur) unter Schütteln bei 37 °C bis zu einer OD600nm von 0,6 angezogen und 30 min auf Eis gekühlt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 4000 g geerntet, zweimal mit 50 ml eiskaltem 10 % Glycerin gewaschen und in eiskaltem GYT (10 % Glycerin, 0,125 % Hefeextrakt und 0,25 % Trypton) bis zu einem Gesamtvolumen von 0,2 ml resuspendiert. Die so gewonnenen kom-petenten Zellen konnten aliquotiert bei -70 °C über mehrere Monate gelagert werden.

Zur Einbringen von Fremd-DNA wurden 50 µL elektrokompetente E. coli mit 1 µl Plasmid-DNA gemischt und in einer vorgekühlte Elektroporationsküvette (Eurogentec, Seraing, Bel-gien) mithilfe eines Stromstoßes von 2400 V für 5,28 ms transformiert (Elektroporationsgerät Cellject Basic, EquiBio, Angleur, Belgien). Sofort wurde dann 1 ml SOC-Medium zugegeben und die Bakterien 1 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden geeignete Mengen davon auf selektive LB-Agarplatten (Antiobiotikumwahl je nach transgenem Plasmid) ausgestrichen, die gewachsenen Transformanten nochmals auf Platten vereinzelt und schließlich als Stammkul-turen (5 ml ÜbernachtkulStammkul-turen, mit 10 % Glycerin versetzt) bei -80 °C eingefroren.

2.13.1.3 Isolierung, Verdau und Reinigung von Plasmid-DNA aus E. coli

Zur Plasmidreinigung aus E. coli wurden alternativ das kommerzielle ‘QIAPrep Spin Plasmid Miniprep Kit’ von Qiagen (Hilden, Durchführung nach Herstellerangabe) oder die klassische Plasmidreinigung verwendet. Der enzymatische Verdau der Plasmid-DNA erfolgte mit geeig-neten Restriktionsendonukleasen der Firma Boehringer (Mannheim) im jeweils empfohlenen Restriktionspuffer (Boehringer, Mannheim). Die DNA wurde mit 1/10 Volumen Probenpuffer (0,25 % Bromphenolblau, 0,25 % Xylencyanol FF, 15 % Ficoll Typ 400) versetzt und in horizontalen Agarosegelen elektrophoretisch bei 75 V aufgetrennt (Agarosegele: 0,8 bis 1,2 % (w/v) Agarose, 40 mM Tris/Acetat, pH 8,0; 1 mM EDTA; Laufpuffer TAE: 40 mM Tris/Acetat, pH 8,0; 1 mM EDTA). Nach 5minütiger Inkubation der Gele in Ethidiumbro-midlösung (1 µg ml^-1) wurde die DNA auf einem UV-Leuchtschirm (Transilluminator TM-20, UVP Inc., San Gabriel, USA) sichtbar gemacht und das gewünschte DNA-Fragment aus-geschnitten. Die DNA-Extraktion aus Agarosegelen wurde mit dem ‘QIAEX II Gel Extraction Kit’ von Qiagen (Heidelberg) entsprechend der beigelegten Anleitung durchgeführt.

2.13.1.4 Sondenherstellung zur mRNA-Detektion

Zur Gewinnung von Sonden zur mRNA-Detektion wurden DNA-Fragmente mit Digoxigenin markiert. Die Methoden der Digoxigenin-Markierung und der Hybridisierung membrange-bundener Nucleinsäuren mit den markierten Gensonden folgte im wesentlichen den Angaben des Herstellers (The DIG System User’s Guide for Filter Hybridization, Boehringer).

2.13.1.4.1 Enzymatische Markierung

Für die Markierungsreaktionen wurden 16 µl DNA (0,5-1 µg) 10 min bei 100 °C denaturiert und anschließend im Eiswasserbad auf 0 °C abgekühlt, mit 4 µl DIG-High Prime (Boehringer) ca. 20 h bei 37 °C inkubiert und die Reaktion durch 2 µl EDTA (0,2 M; pH 8,0) beendet. Die Markierungseffizienz wurde im Vergleich mit markierter λ-DNA (Boehringer) laut Her-stellerangaben im Tüpfeltest bestimmt.

2.13.1.4.2 PCR Markierung

Alternativ zur enzymatischen Markierung wurde PCR-Markierung eingesetzt. Zur Amplifika-tion der cDNA-Sonden aus den jeweiligen Plasmiden wurden folgende Primer verwendet:

T3 : 5‘-AAT TAA CCC TCA CTA AAG GG-3‘ CAT3, GPX

T7 : 5‘-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C-3‘ CAT3, GPX, SOD4 SP6 : 5‘-GCG TAT TTA GGT GAT ACT ATA G-3‘ SOD4

pSOD1-3‘ : 5‘-GCC TTT GCG CTC AAA CGA TAG AG-3‘ SOD1 pSOD1-5‘ : 5‘-CGC CTG GCC TCT CTG GGC ATG-3‘ SOD1 pSOD2-3‘ : 5‘-GCG CAT TCT AAT TCT AAA ATT AGG GC-3‘ SOD2 pSOD2-5‘ : 5‘-CGC CTA AAT TTG AAC TCC AGC CTC-3‘ SOD2 pSOD3-3‘ : 5‘-GCG CCC TGG AGG CCG ATG ATA CC-3‘ SOD3 pSOD3-5‘ : 5‘-GCG GGT GAA GGC CGT TGC CGT CC-3‘ SOD3

Die Ansätze enthielten jeweils 5 µl PCR-Puffer, 38 µl H2O, 5 µl markierte dNTPs, 1 µl DNA-Template, je 0,4 µl Primer und 0,5 µl Taq-Polymerase, die PCR wurde unter folgenden Be-dingungen durchgeführt:

CAT3, GPX, SOD1, SOD2, SOD3 SOD4

Zeit Temperatur Zyklen Zeit Temperatur Zyklen

5 min 94 °C 4 min 94 °C x 1

0,45 min 55 °C x 1

1,30 min 72 °C 1 min 94 °C

1 min 49 °C x 31

1 min 94 °C 1,5 min 72 °C

2 min 55 °C x 30

5 min 72 °C

2.13.2 Isolierung der Gesamt-RNA aus Tabak und Mais

Gesamt-RNA wurde mit TriStar™-Reagenz (AGS, Heidelberg) nach leicht modifiziertem Original-Protokoll von AGS extrahiert. Unter flüssigem Stickstoff gemörsertes, gefrorenes Pflanzenmaterial (ca. 200 mg) wurde mit 1,5 ml TriStar™-Reagenz in 2-ml Eppendorf-Reak-tionsgefäßen unter intensivem Schütteln homogenisiert. Nach 5 min Inkubation bei RT erfolgte die Zugabe von 0,3 ml Chloroform, anschließend wurden die Proben für 15 sec intensiv geschüttelt und weitere 7 min bei RT inkubiert. Nach Zentrifugation (5 min bei 12.000 g, 4 °C) wurde die wässrige obere Phase in ein frisches Reaktionsgefäß überführt und die RNA durch Zugabe von 0,75 ml Isopropanol 10 min bei RT und 1 h bei –70 °C präzipitiert. Die gefällte RNA wurde 10 min mit 12.000 g und bei 4 °C pellettiert und anschließend zweimal mit 4 °C kaltem 70 % Ethanol gewaschen. Zuletzt wurde die RNA 5 min bei RT luftgetrocknet und anschließend in 22,5 µl DEPC-behandeltem H₂O aufgenommen, 10 min bei 55 °C gelöst und ggf. bei –20 °C gelagert. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte über Messung der Absorption bei 260 nm, der Reinheitsgrad der extrahierten RNA wurde mittels des Ab-sorptionsverhältnisses A_{260 nm}/A_{280 nm} abgeschätzt.

2.13.3 Denaturierende Formaldehyd-Agarose-Gelelektrophorese von RNA Zur Auftrennung der RNA wurden 4 µl RNA (4 bzw. 8 µg) mit 2 µl 10fach konzentriertem MOPS-Puffer (200 mM 4-Morpholinopropansulfonsäure, 50 mM Na-Acetat, 10 mM EDTA, pH 7,0), 10 µl deionisiertem Formamid und 3,5 µl Formaldehyd (37%) gemischt, 15 min bei 65 °C denaturiert und 5 min auf Eis gestellt. Die denaturierten RNA-Proben wurden mit 2 µl Proben-Reagenz (50 % Glycerin, 0,4 % Bromphenolblau, 1 mM EDTA) versetzt und in Formaldehyd-Agarose-Gelen (1 % (w/v) Agarose, 2 M Formaldehyd in MOPS-Puffer) bei einer konstanten Spannung von 70 V elektrophoretisch aufgetrennt.

2.13.4 Transfer der RNA auf die Hybridisierungsmembran (Northern-Blotting)

Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel dreimal 7 min in Wasser und einmal 15 min in 20 x SSC (3 M NaCl, 0,3 M Na-Citrat) äquilibriert. Der Transfer auf die positiv geladene Nylonmembranen (Boehringer, Mannheim) erfolgte durch die abwärts-gerichtete Kapillarstrommethode in einer TurboBlotter-Einheit (Schleicher & Schuell, Dassel) über 4 h nach Herstellerangaben. Die RNA wurde für 30 min bei 120 °C im Trockenschrank, bzw.

alternativ für 120 sec unter UV-Licht auf der Membran fixiert.

2.13.5 Hybridisierung mit DIG-markierten Gensonden und Chemilumineszenznachweis

Zur Entfernung von Salz- und Agaroseresten wurde die Membran 1 min in 5 x SSC gewa-schen. Die Prähybridisierung zur Absättigung freier Bindungsstellen auf den Membranen erfolgte in einer Hybridisierungsröhre (Biometra, Göttingen) im Hybridisierungsofen (Bio-metra) bei 42 °C für 1 h mit 20 ml Hybridisierungslösung (50 mM Na-Phosphat pH 7,0;

5 x SSC; 50 % (v/v) Formamid; 7 % (w/v) SDS; 2 % (w/v) Blockierungsreagenz (Boehringer);

0,1 % N-Lauroylsarcosin).

Die markierten Gensonden (s. 2.13.1.4, S. 26) wurden hitzedenaturiert (10 min bei 100 °C, 5 min bei 0 °C) und in 10 ml Hybridisierungslösung gegeben. Anschließend wurde die Prä-hybridisierungs- durch die Hybridisierungslösung ersetzt und die Membran über Nacht bei 42 °C inkubiert.

Im Anschluß wurde die Membran zweimal je 5 min bei RT in 2 x SSC, 0,1 % SDS und zweimal je 15 min bei 65 °C in 0,5 x SSC, 0,1 % SDS gewaschen. Nach Äquilibrierung in Maleinsäurepuffer (0,1 M Maleinsäure pH 7,5; 0,15 M NaCl) mit 0,3 % Tween 20 wurden die Membranen für 1 h in 50 ml Blockierungslösung (Maleinsäurepuffer mit 1 % Blockierungs-reagenz) bei RT inkubiert, um freie Bindungsstellen auf der Membran abzusättigen. Die Kopplung des primären Antikörpers (Anti-Digoxigenin-alkalische-Phosphatase, Boehringer, 1:20.000 in Blockierungslösung verdünnt) fand für 30 min bei RT statt. Es folgten zwei Waschschritte von je 15 min in Waschlösung. Anschließend wurden die Membranen für einige Minuten in Detektionspuffer (0,1 M Tris/HCl pH 9,5; 0,1 M NaCl) äquilibriert und mit dem Chemilumineszenzsubstrat CSPD-Star^TM (Boehringer) benetzt. Zur Detektion des Hybridisierungssignals wurde dann für 5 bis 30 min Chemilumineszenzfilm (Hyperfilm™-ECL, Amersham, Braunschweig) exponiert.